Compound heterozygosis with novel AQP2 gene mutation in sisters affected by autosomal congenital nephrogenic diabetes insipidus

Sorry, this entry is only available in Italiano.

Introduzione

Il diabete insipido nefrogenico congenito (DINC) è una rara patologia caratterizzata dall’incapacità di concentrare le urine nonostante livelli sierici di ormone antidiuretico (ADH) normali o elevati. Il DINC è una delle cause della cosiddetta sindrome poliuria-polidipsia. Le altre due forme principali sono il diabete insipido centrale e la polidipsia primitiva. La diagnosi differenziale tra queste tre forme è ovviamente essenziale per i diversi risvolti terapeutici. Da questo punto di vista il tradizionale approccio diagnostico, basato sul test di deprivazione dell’acqua e sugli effetti della somministrazione di desmopressina, sta progressivamente lasciando il posto a procedure basate sul dosaggio diretto dell’ormone. In realtà il dosaggio dell’ADH risente particolarmente di difficoltà tecniche in funzione anche della sua labilità, tanto da essere stato sostituito, a scopi diagnostici, dal suo segmento C-terminale, la copeptina, secreta in maniera equimolare [1] (Figura 1). Va segnalato che il diabete insipido nefrogenico è più frequentemente una patologia acquisita, secondaria alla resistenza all’ADH dei dotti collettori, perlopiù per danno diretto. Una volta diagnosticato, una attenta anamnesi e un accurato approfondimento diagnostico sono necessari per riconoscerne le cause [2] (Figura 2).

 

Nella popolazione generale la prevalenza di DINC è approssimativamente di un caso ogni 1˙000˙000 [3]. Nel 90% dei casi Il DINC è ereditato come tratto X-linked  causato da mutazioni del gene che codifica per il recettore di tipo 2 dell’ADH (ADHR2), localizzato sul cromosoma X al locus Xq28 [4]. I restanti casi hanno una ereditarietà autosomica recessiva (9%) o dominante (1%) e sono causati da mutazioni del gene per le acquaporine di tipo 2 (AQP2) localizzato sul cromosoma 12 al locus 12q13 [5]. Il gene AQP2 codifica per una proteina trans-membrana di tipo IV-A di 271 aminoacidi, caratterizzata da sei domini trans-membrana connessi da cinque loop che formano uno stabile tetramero con le estremità amminica e carbossilica intracellulari [6]. Il legame tra l’ADH e il suo recettore ADHR2, localizzato sul versante baso-laterale delle cellule del dotto collettore del nefrone, determina l’attivazione del recettore e il conseguente flusso di vescicole di trasporto contenenti AQP2 dai depositi intracellulari del reticolo endoplasmatico (RE) al versante apicale della membrana cellulare [7]. L’aumento dell’espressione di AQP2 nelle membrane cellulari dell’epitelio dei dotti collettori si traduce in un netto aumento della permeabilità all’acqua a questo livello del nefrone. Il gradiente osmotico che fornisce la “forza” per tale flusso di acqua è generato dal riassorbimento di NaCl e urea nel tratto sottile ascendente dell’ansa di Henle e nella midollare nel dotto collettore.

Fino ad oggi (dicembre 2019) sono state descritte 61 mutazioni del gene AQP2: 48 missense, 3 splicing (una di queste con ruolo patogenetico incerto), 9 piccole delezioni e 1 piccola inserzione [8]. Le evidenze sperimentali suggeriscono che la malattia sia dovuta principalmente ad anomalie di localizzazione di AQP2 piuttosto che alla loro ridotta funzione. È interessante notare che le mutazioni autosomiche recessive di AQP2 determinano una alterazione della struttura tridimensionale della proteina (misfolding) che ne provoca la ritenzione nel RE; in questi casi, il grado di misfolding di AQP2 e la conseguente possibilità di superare il controllo del RE determinano la severità del fenotipo del DINC [9]. Di contro, nel DINC autosomico dominante, le mutazioni provocano la compromissione dei meccanismi che regolano il flusso della proteina dal RE alla membrana; in questo caso è la quantità di proteina che raggiunge correttamente la membrana cellulare a determinare il fenotipo della malattia [10]. Quest’ultimo aspetto è di grande interesse per la sfida terapeutica del DINC, sfida che dovrebbe essere affrontatata non somministrando farmaci per compensare le anomalie fisiopatologiche della malattia, che ad oggi è l’unica possibilità, bensì restaurando i corretti meccanismi di gestione intracellulare di AQP2 e determinandone l’adeguata espressione sulla membrana cellulare.

 

Caso clinico

Descriviamo il caso di due sorelle, di 30 e 27 anni rispettivamente, prese in carico dalla nostra Unità dopo essere state gestite per molti anni da un ospedale pediatrico. Alla sorella maggiore (Paziente 1) era stata posta diagnosi di DINC a 6 mesi di vita, dopo lunghi periodi di ospedalizzazione per continui episodi di disidratazione e febbre. La diagnosi era stata poi confermata dal test alla desmopressina. Nel caso della sorella minore (Paziente 2), che presentava gli stessi sintomi alla nascita, la diagnosi era stata invece più precoce.

All’ammissione nel nostro Centro, la terapia consisteva per entrambe in indometacina, misoprostolo e nell’associazione amiloride/idroclorotiazide, ossia la terapia di riferimento del DINC. Indometacina e idroclorotiazide (HCT) sono somministrate con l’obiettivo di ridurre il volume urinario. L’indometacina, attraverso l’inibizione delle prostaglandine e prostacicline glomerulari, determina la vasodilatazione delle arteriole afferente ed efferente, con conseguente riduzione del flusso di perfusione glomerulare. L’HCT invece, determinando una fase depletiva del volume extracellulare attraverso il blocco del riassorbimento distale di Na, ne induce l’aumento compensatorio in quello prossimale. L’amiloride è invece somministrata come risparmiatore di potassio, per compensare l’effetto depletivo dell’HCT. Il misoprostolo infine è somministrato per la prevenzione degli effetti gastrolesivi a lungo termine della terapia con indometacina.

In seguito a tale terapia, il volume urinario era compreso tra i 10 e i 15 lt/die; le pazienti erano in buon equilibrio volemico, con funzione renale nei limiti. La Paziente 1 era obesa (BMI 39), in psicoterapia per un disturbo della condotta alimentare di tipo bulimico e iperuricemica. Entrambe le sorelle erano abituate ad assumere adeguate quantità di liquidi, come evidenziato dal riscontro solo episodico di sodiemie al limite alto del target, con PS urinario comunque mai superiore a 1006; entrambe, inoltre, seguivano un regime alimentare iposodico. Nonostante il grande volume urinario, le sorelle erano affette da microlitiasi associata a ipercalciuria, iperossaluria, ipocitraturia e lieve deficit di 25-OH-vitamina D; calcemia, fosforemia e iPTH erano invece nella norma, mentre iperuricuria, come già accennato, era evidenziabile solo nella Paziente 1.

Allo scopo di ridurre il rischio litogeno abbiamo prescritto supplementi orali di citrato di potassio (principale inibitore della nucleazione dei cristalli nelle urine) e di calcio, giacché l’aumento della disponibilità di calcio determina la formazione nel canale enterico di complessi calcio/ossalati con la conseguente riduzione dell’assorbimento di quest’ultimi. La Paziente 1 assumeva inoltre allopurinolo. Per il trattamento dell’ipercalciuria entrambe assumevano idroclorotiazide, utilizzata per aumentarne il riassorbimento a livello prossimale. Durante il follow up le pazienti non hanno mai mostrato segni di danno renale e solo negli ultimi tre anni l’esame delle urine si è positivizzato per proteine, con proteinurie delle 24h comprese tra 0,3 e 0,9 gr. A causa di questo riscontro abbiamo interrotto il trattamento con indometacina, senza tra l’altro che questo abbia indotto rilevanti aumenti del volume urinario. Dal momento che la proteinuria non ha mai superato il grammo nelle 24h non abbiamo tuttavia prescritto ACEi, il cui effetto in pazienti normotesi con questo particolare setting fisiopatologico è uno stimolante argomento di indagine futura. Nel contesto di un episodico riscontro di lieve ectasia pelvica in relazione al carico idrico, gli esami strumentali hanno evidenziato reni con struttura ecografica nella norma. Le caratteristiche cliniche delle pazienti sono riassunte in Tabella I.

 

Le due sorelle sono gli unici casi noti di DINC nella loro famiglia, a suggerire un’ereditarietà di tipo autosomico recessivo senza però poter escludere una condizione X-linked (a causa del fenomeno dell’inattivazione non casuale del cromosoma X). Per confermare la diagnosi molecolare abbiamo sottoposto le pazienti a reazione a catena delle polimerasi (PCR) e sequenziamento dei geni codificanti per ADHR2 e AQP2. Nel gene per ADHR2 sul cromosoma X al locus Xq28 non è stata trovata alcuna mutazione, mentre una condizione di eterozigosi composta è stata riscontrata nel gene per AQP2 sul cromosoma 12 al locus 12q13. Una delle due mutazioni, c.439G>A, che consiste nella sostituzione in posizione aminoacidica 147 di una alanina con una treonina (p.Ala147Thr), era già nota responsabile di DINC [11]. Questa mutazione missense porta alla trascrizione di una proteina AQP2 più grande (32 KDa) rispetto al fenotipo naturale di 29 KDa, proteina che è quindi ritenuta nel RE. Gli autori concludevano per un pathway ereditario di tipo autosomico recessivo. L’altra mutazione riscontrata nelle nostre probande è stata una missense mai descritta prima, che consiste nella sostituzione in posizione nucleotidica 551 di una adenina con una citosina (c.551A>C); consensualmente, ciò causa la sostituzione in posizione aminoacidica 184 di una asparagina con una treonina (p.Asn184Thr) (Figura 3).

 

Per confermare la segregazione allelica è stata estesa l’analisi genetica anche ai genitori. Abbiamo trovato una condizione di eterozigosi per la mutazione c.439G>A nel padre, mentre la madre è risultata eterozigote per la nuova mutazione c.551A>C (Figura 4). La mutazione c.551A>C (p.Asn184Thr) ha un Grantham score di 65 ed è stata analizzata in silico con diversi programmi. Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org) considera la mutazione come responsabile di malattia, confermando l’invariabilità dell’asparagina in posizione 184 della sequenza altamente conservata Asn-Pro-Ala in molte specie animali. Similmente il CADD (Combined Annotation Dependent Depletion, https://cadd.gs.washington.edu/) assegna a questa mutazione un punteggio di 27,9, in linea con i punteggi delle più perniciose variazioni note del gene. PoliPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2, http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) considera la mutazione come potenzialmente dannosa (0.995; sensibilità: 0.68; specificità: 0.97). SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant, http://siftdna.org) e FATHMM (Functional Analysis through Hidden Markov Models, http://fathmm.biocompute.org.uk/) considerano la mutazione come deleteria. La mutazione infine non è presente nel database ExAC (Exome Aggregation Consortium).

 

 

Discussione

In questo studio riportiamo il caso di due sorelle affette da DINC, uniche figlie malate di genitori sani ma portatori di due diverse mutazioni autosomico-recessive. Nessun altro membro della famiglia risulta malato, ma è possibile ipotizzare la presenza di portatori eterozigoti di ciascuna mutazione. È interessante notare che le due pazienti sono state prese in carico con la diagnosi di DINC X-linked. Supponiamo che, a suo tempo, tale diagnosi sia stata posta solo per la sua maggiore prevalenza rispetto alle forme autosomiche, poiché il pedigree della famiglia orienterebbe in una direzione diversa. Infatti, nel caso di DINC X-linked, sarebbe stato logico riscontrare un qualche sintomo nel padre, che invece è sano, o in qualche altro maschio della famiglia, cosa che invece non risulta all’indagine anamnestica. Inoltre, sebbene il fenomeno dell’inattivazione non casuale del cromosoma X possa spiegare una certa variabilità fenotipica del DINC X-linked nelle donne eterozigoti [13], le pazienti hanno un fenotipo completo e severo, mentre la madre risulta sana così come altri membri della famiglia di sesso femminile. Tutte queste motivazioni giustificavano i dubbi sul modello ereditario diagnosticato precedentemente.

A nostro giudizio, il risultato dell’analisi genetica in queste pazienti è particolare: se la mutazione paterna c.439G>A era già nota come responsabile di DINC, la mutazione materna invece, c.551A>C, non era mai stata descritta prima. Anche prima dell’analisi in silico era possibile ipotizzare che questa mutazione missense avesse un ruolo rilevante come causa di DINC: essa infatti colpisce il 184^mo aminoacido della proteina AQP2, che cade proprio in una delle sequenze altamente conservate Asn-Pro-Ala (i cosiddetti NPA motif) presenti nelle acquaporine di tutte le specie animali. La sequenza 184-185-186 nel versante extracellulare delle cellule tubulari e quella 68-69-70 in quello intracellulare, una volta attivate, si ripiegano all’interno della membrana formando il vero canale dell’acqua [14,15]. Va rimarcato che la mutazione missense in posizione 185 era già stata già descritta nel 1995 da Bichet come possibile causa di DINC [16]; allo stesso modo, la mutazione puntiforme in posizione 68 era stata indicata come responsabile di DINC da Mulders nel 1997 [11]. La mutazione da noi identificata riguardava la posizione aminoacidica 184, a carico quindi di uno dei due NPA motif dell’acquaporina il che, visto anche il ruolo patogenetico di mutazioni di significato sovrapponibile riportate in letteratura, lasciava pochi dubbi sul fatto che la descritta sostituzione dell’asparagina con la treonina in posizione 184 corrispondesse ad un fenotipo patologico. Tale responsabilità è stata poi dimostrata dalla segregazione allelica e dalle predizioni in silico. Poiché entrambi i genitori sono sani, possiamo confermare il modello di ereditarietà recessivo sia per la mutazione già nota c.439G>A che per quella appena identificata, c.551A>C.

Altro spunto di discussione di questo caso clinico è rappresentato dal significato fisiopatologico e clinico della proteinuria. Questo riscontro caratterizza gli ultimi tre anni della storia clinica delle due pazienti, con la stessa entità e tempistica. La sincronicità dell’insorgenza di questo segno di danno renale fanno pensare ad un’eziologia comune in un setting fisiopatologico comune. Visto che in nessuna delle due sorelle si è mai riscontrata microematuria, le ipotesi eziologiche più concrete sono a nostro avviso tre. La prima è un danno tubulo-interstiziale da indometacina, che è stata assunta per moltissimi anni. Questa ipotesi giustifica il nostro tentativo di sospensione del farmaco cui però, a distanza di circa due anni, non sono seguite modifiche rilevanti della proteinuria; vista l’assenza di qualsiasi aumento del volume urinario, si è comunque ritenuto di non reintrodurre il farmaco. La seconda ipotesi fa riferimento ancora a un danno tubulo-interstiziale secondario all’iperossaluria e all’ipercalciuria. In questo caso ci aspettiamo in futuro un’evoluzione divergente tra le due sorelle, vista la maggiore efficacia della terapia nella Paziente 2 che esibisce anche più compliance terapeutica rispetto alla sorella. Più speculativa invece è la terza ipotesi. È acquisito il ruolo della stimolazione dei recettori dell’ADH a livello renale nell’evoluzione della nefropatia cronica. Sappiamo anche come la stimolazione dei recettori dell’ADH di tipo 1 localizzati nelle arterie interlobulari, nei vasa recta, nelle arteriole efferenti, nella macula densa, nelle cellule mesangiali e dei dotti collettori determini iperfiltrazione glomerulare, glomerulosclerosi e proteinuria; questo effetto è secondario ad un’azione sia diretta sia mediata dall’attivazione del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAS) [17]. Anche gli ADHR2 sono coinvolti in questi eventi. Consideriamo inoltre che nel DINC i livelli di ADH possono essere alti a causa dell’inefficacia della stimolazione recettoriale (feedback negativo). Da questo punto di vista, il dosaggio della copeptina e il trattamento con ACEi o sartani rappresentano una stimolante prossima opportunità per le nostre due pazienti.

Al momento non abbiamo ravvisato indicazione alla biopsia renale: la proteinuria inferiore a 1 gr/24h, l’assenza di microematuria, la funzione renale normale, l’assenza di altri segni o sintomi di malattia, gli stessi scenari fisiopatologici descritti sopra, sono tutti gli aspetti a sostegno della nostra decisione.

Un’ultima considerazione concerne l’altra singolarità del fenotipo delle due sorelle: la microlitiasi. Il loro profilo di rischio litogeno è particolarmente rilevante poiché caratterizzato dalla positività di tutte e tre le principali alterazioni pro-litiasiche: l’ipercalciuria, l’iperossaluria e l’ipocitraturia. Sebbene l’approfondimento di questo quadro metabolico esuli dallo spirito di questo lavoro vale la pena illustrarne velocemente la peculiarità. Ad eccezione dell’ipocitraturia, potenzialmente secondaria all’uso cronico di HCT (l’aumento del riassorbimento prossimale di sodio può coinvolgere anche il cotrasportatore sodio-dicarbossilato NaDC1, responsabile del riassorbimento del citrato [18]; è difficile identificare l’eziologia delle altre anomalie metaboliche. Non sono, infatti, riscontrabili le cause più frequenti di ipercalciuria (ipervitaminosi D, iperparatiroidismo, osteoporosi), così come diete a particolarmente alto contenuto di calcio, escluse dal riscontro di iperossaluria che, quando di origine enterica, è invece secondaria a diete ipocalciche. Resta così spazio ad ipotesi legate alle forme idiopatiche rare a carattere genetico di questi dismetabolismi; rare sì ma certamente meritevoli di futuri studi, considerando i sorprendenti aspetti del DINC di queste due pazienti.

 

Conclusioni

Future analisi in vivo dovranno chiarire se la mutazione c.551A>C comporti la trascrizione di una proteina AQP2 ritenuta nel RE a causa dell’alterazione della sua struttura tridimensionale, com’è tipico per le mutazioni autosomiche recessive, o in una proteina correttamente localizzata ma con funzione compromessa a causa della mutazione della sequenza NPA 184-185-186.

Quanto agli aspetti più specificamente clinici, l’approfondimento istopatologico resta un’opzione diagnostica da considerare in relazione a quella che sarà l’evoluzione della nefropatia delle due pazienti.

 

 

 

Bibliografia

1. Timper K, et al. Diagnostic Accuracy of Copeptin in the Differential Diagnosis of the Polyuria-polydipsia Syndrome: A Prospective Multicenter Study. J Clin Endocrinol Metab 2015; 100(6):2268-74.
2. Balla A, Hunyady L. Nephrogenic Diabetes Insipidus. In: Igaz P, Patócs A (eds). Genetics of Endocrine Diseases and Syndromes. Experientia Supplementum 2019; 111:317-39.
3. Devuyst O. Physiopathology and diagnosis oh nephrogenic diabetes insipidus. Ann Endocrinol 2012; 73(2):128-9.
4. Seibold A, Brabet P, Rosenthal W, Birnbaumer M. Structure and chromosomal localization of the human antidiuretic hormone receptor gene. Am J Hum Genet 1992; 511:1078-83.
5. Morello JP, Bichet DG. Nephrogenic diabetes insipidus. Ann Rev Physiol 2001; 63:607-30.
6. Bai L, Fushimi K, Sasaki S, Marumo F. Structure of Aquaporin-2 Vasopressin Water Channel. J Biol Chem 1996; 271:5171-6.
7. Moeller HB, Ritting S, Fenton RA. Nephrogenic diabetes insipidus: Essential insight into molecular background and potential therapies for treatment. Endocr Rev 2013; 34(2):278-301.
8. The Human Gene Mutation Database. 
9. Milano S, Carmosino M, Gerbino A, Svelto M, Procino G. Hereditary nephrogenic diabetes insipidus: Pathophysiology and possible treatment. An update. Int J Mol Sci 2017; 18(11):2385.
10. Fujiwara TM, Bichet DG. Molecular biology of hereditary diabetes insipidus. J Am Soc Nephrol 2005; 16:2836-46.
11. Mulders SM, Knoers NV, Van Lieburg AF, Monnens LA, et al. New mutations in the AQP2 gene in nephrogenic diabetes insipidus resulting in functional but misrouted water channels. J Am Soc Nephrol 1997; 8(2):242-8.
12. Marr N, Bichet DG, Hoefs S, Savelkoul PJM, Konings IBM, et al. Cell-biologic and functional analyses of five new Aquaporin-2 missense mutations that cause recessive nephrogenic diabetes insipidus. J Am Soc Nephrol 2002; 13(9):2267-77.
13. Arthus MF, Lonergan M, Crumley MJ, Naumova AK, Morin D, et al. Report of 33 novel AVPR2 mutations and analysis of 117 families with x-linked nephrogenic diabetes insipidus. J Am Soc Nephrol 2000; 11:1044-55.
14. Nielsen S, Frøkiaer J, Marples D, Kwon TH, Agre P, Knepper MA. Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev 2002; 82:205-44.
15. Robben JH, Knoers NV, Deen PM. Cell biological aspects of the vasopressin type-2 receptor and aquaporin 2 water channel in nephrogenic diabetes insipidus. Am J Physiol Renal Physiol 2006; 291:257-70.
16. Bichet DG. In: Abstract from the American Society of Nephrology 28th annual meeting. November 5-8, 1995. J Am Soc Nephrol 1995; 6:303-1124.
17. Bolignano D, Zoccali C. Vasopressin beyond water: implications for renal diseases. Curr Open Nephrol Hypertens 2010; 19:499-504.
18. Marangella M. Impiego del citrato nel paziente con nefrolitiasi. G Ital Nefrol 2017;34(4):51-60.