Diagnostic and prognostic markers of renal cell carcinoma

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Introduzione

Il carcinoma a cellule renali (RCC) è l’istotipo più comune di neoplasia renale e rappresenta circa il 3% di tutte le neoplasie adulte nei paesi occidentali [1]. L’incidenza di questa neoplasia, più elevata negli uomini e nelle società economicamente sviluppate, aumenta progressivamente in relazione all’età ed il tasso di mortalità complessivo è pari a 2,2 casi/100.000 abitanti l’anno [2]. L’età media dei pazienti alla diagnosi è stimata intorno ai 64 anni; tuttavia il 3-5% di tutti gli RCC segue una trasmissione ereditaria, con esordio neoplastico in età giovanile [3].

Soltanto una piccola percentuale di pazienti (6-10%) manifesta la classica triade di presentazione clinica con ematuria grave, dolore e massa palpabile al fianco [4]. Infatti, a causa del decorso clinico solitamente asintomatico e di un utilizzo sempre più diffuso di tecniche radiologiche non invasive, quali l’ecografia e la TC addominale, la diagnosi della maggior parte delle neoplasie renali avviene casualmente a seguito di indagini diagnostiche svolte per altre patologie e spesso evidenzia una neoplasia già in fase avanzata. Il RCC è la neoplasia con il più alto tasso di mortalità tra i tumori genitourinari ed i fattori di rischio principali sono rappresentati dal fumo, dall’obesità e dall’ipertensione, nonché dall’inattività fisica e da una storia familiare di diabete mellito [5,6]. In questa neoplasia il sistema immune svolge un ruolo determinante nell’evoluzione della patologia [7]. Tuttavia, indagini condotte su individui con una storia familiare di RCC hanno evidenziato un incremento del rischio legato a fattori genetici [8].

Il RCC comprende un gruppo eterogeneo di neoplasie derivate dalle cellule epiteliali tubulari. Il tipo più frequente di tumore del rene nell’adulto è l’adenocarcinoma: esso si riscontra nel 90% dei casi e in una piccola percentuale di essi (2%) può anche essere bilaterale, cioè manifestarsi in entrambi i reni. Ne esistono tre varianti principali: la variante a cellule chiare (ccRCC), la variante papillare (pRCC) e la variante cromofoba (chRCC). I restanti istotipi sono molto rari ed hanno una incidenza inferiore all’1% dei casi [9]. Il ccRCC è la forma più frequentemente diagnosticata e, sulla base della sua naturale tendenza metastatica, è anche quella clinicamente più severa. Considerando, infatti, tutti i pazienti affetti da RCC metastatico all’esordio, nel 83-88% dei casi l’esame istologico evidenzia un ccRCC. Questa forma è anche responsabile di circa il 90% dei decessi per RCC [10].

Il RCC è una neoplasia resistente ai comuni protocolli di chemioterapia e radioterapia, pertanto le strategie terapeutiche attualmente in uso si basano sostanzialmente sull’approccio chirurgico (nefrectomia radicale e/o parziale). Il tasso di sopravvivenza a 5 anni dopo l’intervento chirurgico è stimato intorno al 70-80% per i pazienti con neoplasia localizzata mentre è inferiore al 10% per le forme metastatiche. Questa netta discrepanza nella sopravvivenza tra pazienti metastatici e non metastatici evidenzia come sia cruciale diagnosticare il RCC quanto più precocemente possibile [11].

 

I biomarcatori nel carcinoma renale

La ricerca di biomarcatori affidabili rappresenta il principale obiettivo nel campo dell’oncologia. I biomarcatori sono delle sostanze di diversa natura molecolare, per lo più proteine, che in molti casi costituiscono un parametro misurabile della presenza, progressione e/o recidiva di un tumore. Tuttavia, allo stato attuale, non esiste alcun marcatore tumorale assoluto che abbia sia la proprietà di essere esclusivamente misurabile in condizioni neoplastiche, sia di essere assente in condizioni di normalità.

Attualmente sono stati stabiliti diversi parametri predittivi per la prognosi di RCC, tra cui lo staging (TNM) ed il grading (Fuhrman) della neoplasia, il sottotipo istologico ed altri parametri clinico-laboratoristici come l’ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) Performance Status, il livello di emoglobina o di lattato deidrogenasi. Tuttavia, per una più accurata valutazione dei risultati ed in linea con la necessità di sviluppare protocolli terapeutici personalizzati sulla base delle caratteristiche di ciascun paziente e della singola neoplasia (medicina di precisione), diversi studi si sono orientati alla ricerca e all’identificazione di nuovi biomarcatori, che siano in grado di rafforzare gli attuali strumenti di indagine diagnostica e predizione prognostica (Tabella I).

 

Biomarcatori diagnostici
BFGF	Cellule GSE6344	↑ Espressione
Caspasi 3/7	Cellule UOK257-FLCNnull	↑Attività
AMP- ciclico	Cellule FH delete	↑ Espressione
ES	Topo nudo	↑ Espressione
FH	Tessuti tumorali, cellule 786-O, A498, RCC4, ACHN	↓ Espressione
FH	Cellule UOK268	↓ Attività
FH	Cellule HEK293T	↓ Espressione
FH	Cellule renali epiteliali di topo Fh1ft/ft	↑ Espressione
HIF-2α	Cellule A498, 786-O, VHL delete	↑ Espressione
HIF-1α	Cellule UOK261	↑ Espressione
HIF-1	Cellule GSE6344, Cellule Elthem	↑ Espressione
Metilazione del DNA	Tessuti tumorali	↓ Espressione
Recettore PDGF	Cellule GSE6344	↑ Espressione
Porfirine	Cellule renali epiteliali di topo Fh1ft/ft	↑ Espressione
VEGFR	Cellule GSE6344	↑ Espressione
Biomarcatori prognostici
Acetil CoA carbossilasi	446 Tessuti tumorali	↑ Espressione
AMPK	446 Tessuti tumorali	↓ Espressione
ANXA 2	Cellule UOK261	↑ Espressione
B7-H1	298 Tessuti tumorali	↓ Espressione
B7-H1	306 Tessuti tumorali	↓ Espressione
B7-H4	259 Tessuti tumorali	↓ Espressione
CAIX	321 Tessuti tumorali	↓ Espressione
CD57+	120 Tessuti tumorali	↓ Espressione
cIAPI	104 Tessuti tumorali	↑ Espressione
CRP	100 Sieri	↑ Espressione
CX3CR1	78 Tessuti tumorali	↑ Espressione
CXCR3	154 Tessuti tumorali	↓ Espressione
Acido decosaesanoico	112 Sieri	↓ Espressione
EGFL7	Cellule 786-0, HMEC-1	↑ Espressione
EIf4E	135 Tessuti tumorali	↑ Espressione
ESR	1075 Sieri	↑ Espressione
FABP7	60 Tessuti tumorali	↑ Espressione
GLI1 E GLI2	Cellule hk-2, 786-0, 769-p	↑ Espressione
Trasportatore di glutammina	446 Tessuti tumorali	↑ Regolazione
HIF-1α	92 Tessuti tumorali	↑ Espressione
HSC71	20 Tessuti tumorali	↑ Espressione
IMP-3	371 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Iron	Cellule SN12C	↓ Espressione
Kappa B	Cellule 786-0	↑ Espressione
Ki-67	321 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Neutrofili	120 Sangue intero	↑ Espressione
p27	67 Tessuti tumorali	↓ Espressione
p53	193 Tessuti tumorali	↑ Espressione
p53	Cellule HEK 293, Caki-1, Caki-2, A498	↑ Espressione
Pathway del pentoso fosfato	446 Tessuti tumorali	↑ Regolazione
pAKT nucleare	375 Tessuti tumorali	↓ Espressione
pAKT citoplasmatica	375 Tessuti tumorali	↑ Espressione
p4E-BP1	135 Tessuti tumorali	↑ Espressione
pATM S1981	Cellule HEK 293, Caki-1, Caki-2, A498	↑ Espressione
p-S6k	375 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Pontina	20 Sieri	↑ Espressione
PTEN	375 Tessuti tumorali	↓ Espressione
PTEN	446 Tessuti tumorali	↓ Espressione
PUMA	Cellule HEK 293, Caki-1, Caki-2, A498	↑ Espressione
Reptina	67 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Survivina	298 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Survivina	670 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Proteina UBE3C	297 Tessuti tumorali	↑ Espressione
VEGF e VEGFR	229 Tessuti tumorali	↑ Espressione
Proteina β-catenina	297 Tessuti tumorali	↑ Espressione

Tabella I: Principali biomarcatori diagnostici e prognostici di RCC. Modificato da Di Pietro G, Luu HN, Spiess PE, et al. Biomarkers and new therapeutic targets in renal cell carcinoma. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2018; 22(18):5874-91

 

Marcatori genetici associati al carcinoma renale

Il RCC è un tumore per certi versi enigmatico, tuttavia negli ultimi anni i progressi nell’ambito della genetica hanno permesso non solo di comprendere meglio i meccanismi patogenetici alla base dello sviluppo neoplastico ma anche di identificare nuovi biomarcatori molecolari. Infatti, nella maggior parte dei casi di ccRCC, sembrano giocare un ruolo fondamentale i fenomeni di ipermetilazione o le mutazioni loss of function che interessano il gene oncosoppressore VHL, localizzato sul cromosoma 3 (locus 3p25), comunemente responsabile della Sindrome di Von Hipple-Lindau. Tale sindrome predispone i soggetti affetti allo sviluppo di tumori benigni e maligni, infatti quasi il 75% dei pazienti con Sindrome di Von Hipple-Lindau sviluppa ccRCC [12]. La proteina codificata, pVHL, presenta un’attività ubiquitina ligasi ed ha come target HIF-1 (hypoxia-induced factor 1), un fattore trascrizionale costituito da due subunità: HIF-1α e HIF-1β. In condizioni fisiologiche, HIF-1α viene prodotto e regolato a livello post-traduzionale mediante una reazione di idrossilazione su due residui di prolina altamente conservati (P402 and P564) tramite gli enzimi prolil-idrossilasi (PHD) e HIF prolil-idrossilasi (HPH) che utilizzano l’ossigeno come principale substrato di reazione. L’idrossilazione della prolina indirizza, successivamente, HIF-1α al legame con pVHL e alla degradazione mediata da proteasoma. In condizioni di ipossia HIF-1α non può essere idrossilato né degradato e, legandosi alla subunità beta, attiva diversi geni target a valle, mediando gli effetti dell’ipossia e garantendo la sopravvivenza cellulare. Tuttavia, nell’ambito della carcinogenesi, l’effetto di HIF-1 è tutt’altro che vantaggioso. In pazienti con mutazioni nel gene VHL, vi è una stabilizzazione di HIF-1 anche in condizioni di normossia. Ne consegue un’aumentata trascrizione di alcuni geni chiave regolati da HIF, tra i quali VEGF, PDGF, TGF-β, EGFR, IGF, GLUC1, EPO, CXCR4, che a loro volta promuovono la neoangiogenesi, la crescita cellulare, il trasporto del glucosio ed i processi di metastatizzazione. Ne consegue che i tumori ccRCC sono ricchi di lipidi e glicogeno e risultano altamente vascolarizzati [13, 14]. In particolare, è stato dimostrato che l’espressione di VEGF, uno dei più importanti fattori angiogenici, si correla con lo stadio TNM più severo delle diverse forme di RCC. In studi successivi, l’aumentata espressione di VEGF e del suo recettore sono risultati associati ad una scarsa sopravvivenza dei pazienti, mentre il riscontro di mutazioni del gene VEGFR-3, nell’ambito dei tessuti tumorali, è considerato un indice prognostico negativo [15, 16].

L’inattivazione del gene VHL determina, inoltre, un incremento di HIF-2α che sembra avere un ruolo opposto rispetto ad HIF-1α ed è associato ad un più alto rischio di metastasi a distanza [17]. È stato infatti dimostrato che HIF-1α agisce da oncosoppressore, principalmente inibendo la proto-oncoproteina MYC, un fattore di trascrizione che promuove la proliferazione cellulare e la sintesi proteica e che risulta molto espresso in più del 40% dei tumori umani [18]. Al contrario, HIF-2α potenzia l’espressione di MYC e probabilmente sostiene la progressione neoplastica del ccRCC [19].

La perdita del gene VHL è un fattore necessario ma non sufficiente per indurre lo sviluppo del tumore, sia nelle forme ereditarie che in quelle sporadiche. Negli ultimi anni, gli studi genomici su larga scala hanno identificato mutazioni somatiche in altri geni, quali PBRM1, SETD2, BAP1 e KDM5C, e, sebbene l’esatto ruolo debba essere ancora del tutto chiarito, sembra che agiscano come chromatin modifiers. È interessante notare che PBRM1, SET2 e BAP1 localizzano nel locus 3p21, molto vicino al gene VHL, suggerendo quanto siano importanti le modificazioni a carico del braccio corto del cromosoma 3 nell’oncogenesi del ccRCC [20]. Molto recentemente, in merito al potenziale ruolo prognostico che potrebbe rivestire BAP1, è stato osservato che nei tessuti metastatici di pazienti con ccRCC, il tasso di sopravvivenza a 5 anni, tra coloro che mostravano un’espressione positiva e negativa di BAP1, fosse rispettivamente del 53.2% vs 35.1% (P=0.004) [21].

I fattori di trascrizione della famiglia SOX sono coinvolti in numerosi processi di differenziazione cellulare ed è ormai noto che l’origine di una neoplasia possa derivare da un’alterata riprogrammazione delle cellule staminali all’interno dei tessuti. Come principale marker di staminalità, SOX2 risulta altamente espresso nelle cellule staminali tumorali, conferendo un potenziale metastatico a diversi tipi di cancro. Uno studio recente ha evidenziato come l’espressione di SOX2 sia un fattore prognostico indipendente in grado di influenzare la sopravvivenza complessiva (overall survival o OS) e l’intervallo libero da malattia (disease-free survival o DFS) nei pazienti affetti da ccRCC, sebbene siano necessari ulteriori studi di validazione nella pratica clinica [22–24].

Coinvolto nel processo di cancerogenesi è anche il proto-oncogene MET che codifica per un recettore tirosin chinasico il cui ligando è l’Hepatocyte Growth Factor (HGF), noto anche come Scatter Factor (SF). Il recettore MET, legando HGF/SF, va incontro ad autofosforilazione con conseguente attivazione di numerosi secondi messaggeri in grado di regolare la crescita, la morfologia e la motilità cellulare. Fisiologicamente le cellule renali epiteliali del tubulo prossimale (RPTEC) esprimono il recettore MET. Mutazioni a carico del dominio tirosin chinasico che inducono una fosforilazione costitutiva di questo recettore, sono riscontrate nella maggior parte dei casi di pRCC di tipo 1. L’individuazione di mutazioni nel proto-oncogene MET è, difatti, un indice utile per la diagnosi delle forme ereditarie e sporadiche di pRCC [25]. MET, inoltre, sembra avere un ruolo anche nel ccRCC. Uno studio ha riportato che i recettori MET nelle cellule di ccRCC sono in grado di attivarsi indipendentemente dal legame con HGF/SF, dimostrando come l’autofosforilazione scaturisca dall’inattivazione del gene VHL nelle prime fasi di cancerogenesi. Tuttavia, non tutte le cellule renali con recettori MET costitutivamente fosforilati presentano mutazione nel gene VHL, suggerendo la probabile esistenza di mutazioni a carico di altri geni. Un altro dato interessante per il ccRCC è l’associazione tra MET e HIF-1. Si ritiene infatti che possa essere lo stesso HIF-1, il cui accumulo deriva dall’inattivazione del gene VHL, il responsabile di un’aumentata espressione di MET [26, 27].

Due differenti studi di meta-analisi hanno valutato il potenziale effetto prognostico di due geni coinvolti nell’oncogenesi di RCC. Il gene più studiato e più noto nel campo oncologico, mutato in più del 50% dei tumori umani, è certamente p53, il “guardiano del genoma”, che codifica per la proteina tumorale Tp53 e regola l’apoptosi e la stabilità genomica rivestendo il ruolo di oncosoppressore tumorale. Wang e colleghi hanno osservato che l’espressione di Tp53 nei pazienti RCC riduce l’OS (HR=2.17, 95% CI: 1.51–3.13) e la sopravvivenza cancro-specifica (cancer specific survival, CSS) (HR=1.59, 95% CI: 1.19–2.12) [28]. Lo studio di Que e colleghi, invece, ha osservato che una ridotta espressione di PTEN, omologo della fosfatasi e della tensina, riduce l’OS (HR = 0.57, 95% CIs: 0.45-0.74) ed aumenta il rischio di tumorigenesi con scarsa differenziazione (P < 0.001), metastasi a distanza (P=0.001), metastasi linfonodali e stadio clinico avanzato (P < 0.001), suggerendo un ruolo chiave di PTEN come oncosoppressore nel RCC [29].

Inoltre, mutazioni in Tp53 e PTEN sono le uniche presenti in più del 5% dei casi della variante cromofoba di RCC. Anomalie cromosomiche sono state riscontrate anche nel pRCC: trisomia del cromosoma 7, in cui localizza il gene MET, e del cromosoma 17, perdita del cromosoma Y e la traslocazione t(X;1) (p11.2; q21.2), risultante nella fusione di un nuovo gene, PRCC/TF3, responsabile dello sviluppo del tumore [30,31].

 

Vie di trasduzione del segnale intracellulare e carcinoma renale

Nell’ambito del RCC ha destato notevole interesse tra gli studiosi l’alterazione delle vie di trasduzione del segnale intracellulare che risultano coinvolte in numerosi processi responsabili della progressione tumorale. In particolare, di grande rilevanza è risultata la via di trasduzione del segnale intracellulare EGFR-PI3K-AKT che porta all’attivazione di mTOR (mammalian target of rapamycin). Questa serina-treonina chinasi, che costituisce la subunità catalitica del complesso molecolare mTORC1, è coinvolta in numerosi processi responsabili della progressione tumorale, tra cui crescita e proliferazione cellulare, apoptosi, migrazione ed invasione tissutale.

Il riscontro di mTOR fosforilato sul residuo Ser2448 rappresenta un marker specifico di attivazione del suo pathway nel ccRCC. È stato recentemente osservato che mTOR risulta maggiormente espresso nel tessuto metastatico rispetto al tessuto tumorale primario, con livelli di espressione che risultano significativamente più elevati per la forma fosforilata rispetto alla forma nativa. Inoltre, un elevato rapporto p-mTOR/mTOR è stato correlato alle forme tumorali avanzate (T-stage) con alto grado Fuhrman ed istologia sarcomatoide [32]. La fosforilazione di mTOR, a sua volta, media l’attivazione di fattori target a valle, quali S6K e 4E-BP1. In particolare, 4E-BP1 fosforilato (p4E-BP1), rilasciando il fattore eIF4E, consente il suo legame al mRNA e il reclutamento al complesso di iniziazione ribosomiale. L’incremento di p4E-BP1 si associa ad un maggior rischio di progressione in molte neoplasie e, nell’ambito del ccRCC, è in grado di identificare pazienti con malattia aggressiva e con una peggiore DFS. È stato osservato che pazienti affetti da ccRCC che presentano un’aumentata espressione di p4E-BP1 e eIF4E mostrano una sopravvivenza mediana di 2,9 anni a fronte dei 5,7 anni dei pazienti con uno solo, o nessuno, dei due markers incrementati (p<0,001) [33].

Un altro potenziale marcatore per ccRCC, risulta l’Ubiquitina Protein Ligasi ERC (UBE3C), associata alla crescita tumorale e alla presenza di metastasi. UBE3C, infatti, è in grado di attivare la via di segnalazione Wnt/β-catenina, promuovendo la migrazione e la proliferazione cellulare. Un’elevata espressione di UBE3C nei tessuti tumorali correla significativamente con una scarsa sopravvivenza post-operatoria (p<0.001) [34].

Una ulteriore via di trasduzione del segnale intracellulare compromessa in corso di ccRCC è la via JAK3/STAT5/6, mediata dall’interleuchina 2. Tale pathway regola la normale proliferazione delle cellule T attraverso la soppressione dell’espressione della chinasi p27, essenziale per la transizione di fase G1/S durante il ciclo cellulare. Un recente studio ha evidenziato come le cellule T di pazienti affetti da RCC mostrino una scarsa risposta proliferativa contro gli antigeni tumorali rispetto alle cellule T dei controlli sani, fenomeno legato ad una ridotta espressione di STAT5/6 ed un incremento di p27 [35]. Nel complesso, questi dati giustificano l’alterazione della risposta immunitaria antitumorale che si osserva nel RCC, alterazione caratterizzata in particolare da un arresto del normale ciclo cellulare delle cellule T CD8+ [36].

Un pathway che merita attenzione è quella dell’oncogene MET, la cui regolazione risulta aumentata nei tessuti normali post lesione renale come meccanismo di riparazione e rigenerazione tissutale. Nell’ambito dell’oncogenesi, MET è coinvolto nell’invasività cellulare, nell’angiogenesi, nei meccanismi di inibizione dell’apoptosi e di propagazione di metastasi. Come riportato nel precedente paragrafo, l’interazione MET/HGF induce la fosforilazione di MET, producendo l’innesco di numerosi segnali intracellulari. MET, infatti, è in grado di reclutare diversi adattatori del signaling cellulare tra cui SHC che, interagendo a sua volta con l’adattatore GRB2, recluta l’effettore SOS e attiva la via di trasduzione RAS/RAF/MAPK con effetti sulla proliferazione, progressione ed invasività cellulare. GAB1 E PI3K sono anch’essi adattatori che possono essere reclutati ed attivati da MET, direttamente o indirettamente tramite GRB2, e rispettivamente attivare il signaling RAS/RAF/MAPK o il signaling Akt/PKB promuovendo la sopravvivenza cellulare e l’angiogenesi [37].

Studiare e comprendere questo pathway sta suscitando grande interesse tra i ricercatori per lo sviluppo di strategie terapeutiche di inibizione. Ad esempio, Crizotinib è un inibitore tirosin chinasico (TKI) che ha come target MET ed è attualmente approvato per il tumore polmonare non a piccole cellule; tuttavia, esistono prove a supporto del suo utilizzo nel pRCC. Uno studio di fase 2, CREATE, ha valutato il farmaco in 23 pazienti con pRCC. Tra i quattro pazienti che presentavano alterazioni del MET, uno ha raggiunto uno stato di malattia stabile (stable disease, SD), mentre due hanno ottenuto una risposta parziale (partial response, PR) con una OS a 1 anno del 75,0% [38]

 

Marcatori tissutali associati al carcinoma renale

Sebbene la classificazione dei tumori renali avvenga prevalentemente sulla base delle caratteristiche morfologiche, un aspetto che merita di essere approfondito e che può indirizzare il clinico nella diagnosi è il ricorso a markers immunoistochimici.

PAX8 e PAX2 sono, ad esempio, due fattori di trascrizione espressi dal normale parenchima renale; l’Alpha-methyl CoA racemase (AMACR) è un marcatore diagnostico per pRCC; CD10 è una metalloproteasi di superficie localizzata nei tubuli prossimali del rene adulto ed espressa tipicamente della variante a cellule chiare. Questi markers risultano utili per rilevare a distanza lesioni metastatiche di origine renale, tuttavia non sono specifici per RCC metastatico; per la valutazione di quest’ultimo, dunque, occorrerebbe un pannello che oltre questi includa altri markers specifici dell’organo interessato [39].

Rispetto ad altri istotipi tumorali renali, pRCC e ccRCC esprimono la vimentina, che è marcatore del tessuto mesenchimale [37]. La citocheratina a basso peso molecolare CK7 è utile per discriminare questi due istotipi, in quanto è espressa nella variante papillare ma non in quella a cellule chiare [40]. Il RCC esprime inoltre l’antigene RCC presente nell’orletto a spazzola del tubulo prossimale, l’isoforma 9 dell’anidrasi carbonica (CA-IX), un complesso enzimatico coinvolto nella proliferazione, adesione e invasività cellulare e presente in più del 70% dei RCC, i marcatori epiteliali tra cui citocheratine e EpCam, la parvalbumina, proteina legante il calcio espressa nel tubulo distale e nei dotti collettori tipicamente espressa dal chRCC, l’antigene KI-67 e PTEN. In particolare, CA-IX è una proteina transmembrana espressa dal ccRCC e generalmente assente negli altri istotipi [41]. Un’aumentata espressione dell’antigene KI-67 è, invece, associata alla proliferazione cellulare nei tessuti tumorali primari, alla sopravvivenza globale e libera da recidiva nei pazienti con RCC [42]. È stato osservato che una ridotta espressione di CA-IX, associata ad aumentata espressione della proteina Ki-67, correla con una ridotta sopravvivenza dei pazienti affetti da ccRCC [43]. Un evento cruciale per la progressione tumorale nel ccRCC è la perdita di espressione di PTEN, classico inibitore del pathway PI3K-Akt. Infatti, un’aumentata espressione di Akt, a livello citoplasmatico piuttosto che nucleare, è un fattore inversamente correlato alla sopravvivenza dei pazienti con ccRCC [44].

Uno studio recente ha valutato anche il ruolo dell’eritropoietina (EPO), una glicoproteina della famiglia delle citochine che è il principale fattore di crescita eritropoietico prodotto dalle cellule endoteliali peritubulari della cortex renale negli adulti. Nei tessuti normali non ematopoietici, l’EPO interagisce con il suo recettore di membrana (EPO-R) inibendo, in tal modo, l’apoptosi e promuovendo la proliferazione cellulare, la resistenza ai farmaci e l’angiogenesi. Uno studio ha evidenziato come nel ccRCC la perdita di espressione del EPO-R sia un fattore prognostico negativo indipendente che ha un impatto negativo sia sulla OS, sia sulla DFS [45].

In linea generale, i markers immunoistochimici permettono di caratterizzare i tre principali istotipi di RCC:

• RCC a cellule chiare è generalmente positivo per vimentina, cheratina AE1/AE2, CD10, antigene RCC, CA-IX; negativo per CD117, caderina specifica del rene e parvalbumina.
• RCC papillare di tipo 1 è positivo per vimentina, cheratina AE1/AE2, CK7, AMACR e antigene RCC; negativo per CD117, caderina specifica del rene e parvalbumina. Tuttavia, pRCC di tipo 2 mostra immunoprofili variabili.
• RCC cromofobo è positivo per la caderina specifica del rene, parvalbumina, CD117, EpCAM, cheratina AE1/AE2 e CK7; solitamente negativo per vimentina, CA-IX e AMACR. [46, 47].

 

I miRNA nel carcinoma renale

L’analisi dei microRNA (miRNAs), piccoli RNA endogeni non codificanti, può rivestire un ruolo rilevante in oncologia. I miRNA sono, infatti, in grado di modulare l’espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale, inducendo il silenziamento genico a carico di sequenze complementari presenti sulle molecole di RNA messaggero (mRNA) bersaglio. Tale interazione comporta una repressione della traduzione o la degradazione della molecola bersaglio.

I miRNA interagiscono, naturalmente, con i pathway tumorali. In particolare, è stato osservato che esiste una forte correlazione inversa tra miR-92 (un membro del cluster miR-17-92) e l’espressione di VHL in diversi sottotipi di RCC. I risultati pubblicati hanno suggerito che la sovraespressione di questo miRNA potrebbe avviare l’attività trascrizionale di HIF-1 indipendentemente dalla mutazione VHL e quindi svolgere un ruolo importante nell’induzione e nella progressione del RCC [48]. Un altro studio ha identificato il miR-23b, che contribuirebbe alla progressione del RCC riducendo l’attività della prolil-idrossilasi, con conseguente aumento dei livelli di HIF-1 e mancata degradazione mediata da proteasoma [49]. La famiglia dei miRNA-200 è risultata coinvolta in diversi eventi che favoriscono lo sviluppo del RCC. In particolare, è stata osservata una correlazione inversa rilevante tra i livelli di VEGF e l’espressione di miR-200a, 200b, 200c e miR-141, suggerendo che la perdita di questi miRNA è coinvolta nell’angiogenesi del RCC. Altri studi hanno confermato il ruolo della famiglia miRNA-200 nella transizione epiteliale-mesenchimale del RCC, un processo associato ad un aumentato potenziale di metastasi [50, 51]. Dey e colleghi hanno dimostrato che miR-21, un oncogene up-regolato nella maggior parte dei RCC, potrebbe sostenere la proliferazione e l’invasione tumorale avendo come target il soppressore tumorale PTEN e consentendo quindi l’attivazione a valle di mTORC1 [52].

Anche in merito al pathway del MET, è stato dimostrato che miR-199a-3p, tipicamente down-regolato nel RCC, dopo la trasfezione in diverse linee cellulari di RCC è stato in grado di attenuare il signaling a valle del MET riducendo la proliferazione di quelle cellule [53].

Nel caso del ccRCC, numerosi miRNA sono stati associati all’istotipo, allo stadio ed alla prognosi della neoplasia e la loro modulazione potrebbe avere anche potenziali ricadute terapeutiche. In linea con queste osservazioni, un recente studio ha analizzato i miRNA differentemente espressi dal tessuto tumorale e normale di pazienti affetti da ccRCC, identificando i miRNA-21-5p, miRNA-9-5p, miR-149-5p e miRNA-30b-5p come fattori prognostici indipendenti. Questi quattro miRNA sono in grado di modulare selettivamente più di 1500 geni coinvolti in numerosi pathway correlati al cancro [54].

Slaby e colleghi hanno scoperto che la down-regolazione di miR-106b è associata all’insorgenza di metastasi del ccRCC e dimostrato l’efficacia dell’uso del pannello miR-127-3p, miR-145 e miR-126 per prevedere il rischio di recidiva precoce nei pazienti con RCC metastatico post nefrectomia [55]. Un altro studio ha invece valutato come, nei pazienti in stadio III e IV, la bassa espressione di miR-155, generalmente molto espresso nel RCC rispetto al tessuto renale sano, debba essere considerata come marcatore prognostico sfavorevole [56].

I miRNA sono anche coinvolti nei processi di trasduzione del segnale degli esosomi, piccole vescicole secrete dalle cellule sane e tumorali nei fluidi biologici ed implicati in numerosi processi fisiologici e patologici, come l’infiammazione e la tumorigenesi. Wang e colleghi, recentemente, hanno osservato un incremento nell’espressione tissutale di miR-210, miR-224, miR-452, miR-155 e miR-21 nei tessuti tumorali rispetto ai controlli. I miRNA degli esosomi, riflettendo i cambiamenti molecolari che si verificano nelle cellule d’origine, possono essere utilizzati come potenziali marcatori per una diagnosi tumorale precoce [57].

Tuttavia, nessuno dei markers molecolari attualmente studiati ha dimostrato sufficiente efficacia nella gestione prognostica; pertanto nessuno di essi è attualmente raccomandato per l’applicazione nella pratica clinica di routine. Uno studio retrospettivo ha però valutato l’espressione di miR-15a come potenziale marcatore prognostico per ccRCC, evidenziandone una maggiore espressione nelle lesioni istologiche scarsamente differenziate e con coinvolgimento metastatico ai linfonodi regionali, rispetto a quelle ben differenziate. Anche il tasso di sopravvivenza a 5 anni in associazione ad aumentati livelli di espressione di miR15a è risultato significativamente più breve [58].

I miRNA regolano anche l’espressione di geni coinvolti nello sviluppo dell’immunità innata e adattativa contro il cancro. Uno studio ha osservato come le cellule T CD8+ isolate dai pazienti RCC presentassero difetti nella proliferazione e una propensione all’apoptosi come conseguenza della ridotta espressione di JAK3 e MCL-1, espressione regolata rispettivamente da miR-198 e miR-29b [59].

 

Marcatori non invasivi di carcinoma renale

Il set di biomarcatori ideale dovrebbe essere caratterizzato da un’elevata sensibilità, specificità e riproducibilità. Un aspetto che ha sempre interessato clinici e pazienti è la possibilità di sviluppare protocolli diagnostici sempre meno invasivi che possano consentire lo screening del paziente, la valutazione della risposta al trattamento e il monitoraggio della recidiva della malattia.

Nello studio di Wang e colleghi, oltre all’analisi tissutale di espressione dei profili dei miRNA, è stata condotta una valutazione anche su campioni sierici. Soltanto per il miR-210, i livelli sierici sono risultati particolarmente significativi nei pazienti con ccRCC, per lo più in stadio avanzato e metastatico, rispetto alla coorte sana, conferendogli un potenziale ruolo di marcatore non invasivo per la rilevazione di ccRCC [57].

Il nostro gruppo di ricerca in un recente lavoro ha valutato l’espressione tissutale e sierica dell’oncosoppressore αKlotho in pazienti ccRCC, correlandola con la progressione della malattia. I livelli proteici di αKlotho sono risultati tanto più ridotti nei tessuti tumorali, rispetto ai tessuti normali (p<0.01), quanto più avanzato risultava lo stadio di malattia, e la stessa correlazione inversa si osservava anche nei campioni sierici. Ridotti livelli sierici di αKlotho si associavano ad un significativo peggioramento (p=0,03) della CSS e dell’intervallo libero da progressione (progression free survival, PFS), suggerendo un ruolo determinante del biomarcatore nella progressione tumorale e insorgenza di metastasi [60].

Anche le cosiddette biopsie liquide offrono una prospettiva promettente per la valutazione non invasiva della massa tumorale. Con il termine di biopsia liquida si fa infatti riferimento all’utilizzo di fluidi biologici che rintracciano la “firma molecolare” rilasciata in circolo dalle cellule cancerose. Tra i fluidi biologici, le urine rappresentano il gold standard per la ricerca di biomarcatori nell’ambito delle patologie renali. Mediante approccio proteomico è stato possibile infatti identificare, nelle urine di pazienti affetti da ccRCC, un nuovo biomarcatore Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) la cui escrezione, è risultata ridotta rispetto ai controlli sani. RKIP, correla positivamente con la stadiazione, la presenza di metastasi, il coinvolgimento dei linfonodi e la dimensione del tumore alla diagnosi. Nello stesso studio, inoltre, è stato riportato come i pazienti ccRCC con un livello di escrezione urinaria di RKIP inferiore a 10 ng/mg/g di Pr/uCR alla diagnosi, abbiano un rischio più elevato di progressione della malattia e morte dopo un follow-up di 41 mesi. È interessante notare che RKIP può essere rilasciato nelle urine sia come monomero che come dimero fosforilato (p-RKIP). La valutazione di quest’ultima forma può essere utile per discriminare pazienti affetti da insufficienza renale cronica (CKD) da pazienti affetti da ccRCC, in cui il marcatore fosforilato non è rilevabile sia a livello urinario che tissutale. [61].

Sempre nell’ambito delle biopsie liquide, ciò che negli ultimi anni ha rivelato un enorme potenziale è lo studio delle cellule tumorali circolanti (CTC) e del DNA tumorale circolante (ctDNA). In particolare, l’analisi del ctDNA costituisce un approccio diretto per la valutazione genetica della massa tumorale; tuttavia, quando si tratta di tumori RCC localizzati, la valutazione del ctDNA si è rivelata particolarmente difficile rispetto ad altri tumori solidi. Una analisi quantitativa su plasma ha rivelato che i livelli di ctDNA più alti erano riscontrabili in pazienti con tumori più avanzati e metastatici, rispetto ai tumori localizzati o ai controlli, mostrando una relazione significativa tra la presenza di ctDNA e lo stadio del ccRCC. Rilevare un incremento del ctDNA specifico, potrebbe risultare un utile strumento non invasivo del rischio di recidiva nel follow-up [62,63].

 

Marcatori associati alla risposta alla terapia

Il RCC è tradizionalmente considerato una neoplasia resistente ai comuni protocolli chemio- e radio-terapici. Anche l’immunoterapia, volta a potenziare l’attività immunitaria antitumorale, ha mostrato risultati poco promettenti. Infatti, a partire dagli anni ’90, sono stati testati numerosi protocolli basati sull’utilizzo di citochine come Interferone-α (INF-α) e Interleuchina-2 (IL-2) per il trattamento del RCC metastatico che, tuttavia, hanno fornito una risposta completa o parziale soltanto nel 10-15% dei pazienti. Inoltre, i protocolli immunoterapici, richiedendo dosi estremamente elevate di citochine, sono comunemente associati a nefrotossicità. Pertanto, in virtù della bassa efficacia e della significativa tossicità, l’utilizzo di tale approccio è oggi piuttosto limitato [64].

Soltanto dopo la diffusione di protocolli di target therapy è stato osservato un aumento della sopravvivenza in un più ampio numero di pazienti con RCC. Ciò nonostante, le indicazioni per la selezione del metodo di trattamento mirato non sono ancora chiaramente definite. A questo proposito, di seguito saranno esaminati i dati esistenti sul potenziale predittivo di diversi marcatori proteici che potrebbero essere utili indicatori per la scelta di un farmaco mirato. Sulla base dei risultati di differenti studi clinici, sono stati approvati in diversi paesi nuovi farmaci per la terapia mirata del RCC: Sorafenib, Sunitinib, Pazopanib, Everolimus Temsirolimus, Bevacizumab Axitinib, Cabozantinib e Lenvatinib (Figura 1) (Tabella II) [65].

 

 

 

Sorafenib

Considerata la natura altamente vascolare degli RCC, non sorprende che siano disponibili diverse terapie per sfruttare questa funzionalità. Sorafenib è un farmaco multitarget, che sopprime la proliferazione cellulare e l’angiogenesi, inattivando i recettori tirosin-chinasici (VEGFR-2, VEGFR-3, PDGF-β, RET, C-kit) e serina/treonina chinasici (C-Raf, B-Raf) nelle cellule tumorali e nelle cellule endoteliali tumorali [66]. Sebbene nei primi studi sia stato dimostrato che un elevato livello di espressione del marcatore CA-IX correlava con la PFS e la riduzione della massa tumorale nei pazienti trattati con Sorafenib, in uno studio successivo condotto su 133 pazienti con ccRCC, non è stata trovata alcuna correlazione tra lo stato di espressione di CA-IX e la PFS in 66 pazienti che hanno ricevuto Sorafenib [67].

 

Sunitinib

Sunitinib è un TKI a basso peso molecolare diretto contro i recettori di VEGF e PDGF. Livelli ridotti di VEGFR-3 e VEGF-C sono stati correlati ad una migliore risposta nei pazienti con RCC trattati con Sunitinib dopo un trattamento inefficace con Bevacizumab [65]. Un beneficio del trattamento con Sunitinib rispetto al trattamento con Sorafenib è stato evidenziato da livelli elevati di HIF-2α, CD31 e CA-IX in combinazione con quelli ridotti di VEGFR1 e PDGFR-β (PFS Sunitinib vs Sorafenib: HIF-2α: 25.35 vs 12.6 mesi; CD31: 23.4 vs 13 mesi; CA-IX: 27 vs 17.7 mesi; VEGFR1: 16.15 vs 10 mesi; PDGFR-β: 15.6 vs 10 mesi) [68,69].

 

Pazopanib

Pazopanib è un TKI che sopprime l’angiogenesi interagendo con PDGFR-α e PDGFR-β e con i recettori c-kit di VEGF-1, VEGF-2 e VEGF-3. In particolare, Pazopanib è indicato nel trattamento di prima linea del RCC metastatico e prove sull’efficacia sono state ottenute da numerosi studi clinici che hanno mostrato una PFS tra 8 e 11 mesi, rispetto al trattamento con placebo o al Sunitinib. (Studio VEG105192: Pazopanib/11.1 vs Placebo/2.8 mesi; Studio COMPARZ: Pazopanib/8.3 vs Sunitinib/9.5 mesi; International mRCC Database Consortium (IMDC): Pazopanib/8.3 vs Sunitinib/8.3 mesi) [70].

 

Everolimus e Temsirolimus

Uno dei principali bersagli della terapia antineoplastica nei pazienti affetti da RCC è la serina/treonina chinasi di mTOR che svolge un ruolo rilevante nella regolazione della crescita e della proliferazione cellulare. Everolimus è il primo farmaco orale appartenente al gruppo degli inibitori di mTOR. Analizzando i livelli di espressione di phospho-mTOR e phospho-S6RP, è possibile prevedere l’efficacia del trattamento con questo farmaco, in quanto livelli più alti di queste proteine sono associati ad aumento della PFS [71]. Temsirolimus, invece, inibisce l’attività di mTOR controllando indirettamente la divisione cellulare in seguito al legame con la proteina intracellulare FKBP-12.

La risposta al trattamento con Temsirolimus correla positivamente con l’espressione di phospo-Akt e phospo-S6RP ed è associata ad una più lunga sopravvivenza nei pazienti con RCC metastatico in correlazione con l’aumento dei livelli sierici di LDH [72,73].

 

Axitinib e Bevacizumab

Anche Axitinib e Bevacizumab sono farmaci volti ad inibire l’angiogenesi tumorale. Axitinib presenta un’attività inibitoria selettiva verso VFGFR1-2-3 e PDGFR, mentre il Bevacizumab è un anticorpo monoclonale ricombinante che neutralizza l’attività di VEGF. Al momento, non sono disponibili dati che evidenzino marcatori predittivi per il monitoraggio del trattamento dei pazienti con RCC con questi farmaci.

 

Cabozantinib

Cabozantinib è un TKI che ha diversi target, tra cui c-MET e VEGF. Lo studio di fase 3 METEOR ha riscontrato un miglioramento significativo dell’OS per i pazienti con ccRCC avanzato che hanno ricevuto Cabozantinib rispetto a Everolimus (OS: 21,4 mesi vs 16,5 mesi) [74]. Lo studio di fase 2 CABOSUN ha riscontrato una PFS prolungata nei pazienti ccRCC a basso e medio rischio metastatico trattati con Cabozantinib rispetto a Sunitinib (8,6 mesi vs 5,3 mesi) [75].

 

Lenvatinib

Lenvatinib è un TKI che inibisce selettivamente i recettori VEGF e FGF. Uno studio che ha analizzato l’attività antitumorale di Lenvatinib in pazienti con tumori solidi avanzati ha evidenziato che tra tutti i tipi di tumore studiati, Lenvatinib sembra essere particolarmente attivo nel RCC, con quattro dei nove pazienti con RCC che hanno ottenuto una PR, su un totale di sette PR complessive [76]. Un altro studio ha invece osservato che nei pazienti con RCC avanzato precedentemente trattati con terapia anti VEGF, il trattamento con Lenvatinib o Lenvatinib e Everolimus ha migliorato la PFS rispetto al solo Everolimus (HR: 0.61; p=0.048 e HR: 0.40; p=0.0005 rispettivamente) [77].

 

L’antigene paraneoplastico Recoverin come nuovo biomarker di RCC

Un altro tipo di potenziali biomarcatori tumorali sono gli antigeni onconeurali, proteine neuronali espresse in modo anomalo nelle cellule tumorali. In virtù della loro specificità per le rispettive cellule tumorali e dell’attività immunogenica che porta alla generazione di autoanticorpi sierici, possono implementare l’efficacia di protocolli immunoterapici volti a stimolare la risposta immunitaria contro le cellule di vari tumori [78].

Un esempio eclatante di antigene onconeurale è recoverin che normalmente localizza nei fotorecettori ma può essere espresso in modo anomalo nei tumori maligni. In alcuni casi, l’espressione di recoverin è accompagnata dalla generazione di autoanticorpi anti-recoverin e dallo sviluppo di una sindrome paraneoplastica (retinopatia associata al cancro) [79–81]. Sebbene molti studi abbiano evidenziato la presenza di questo antigene in diversi tumori, l’esatto ruolo di recoverin nel cancro è ancora da definire. In particolare, l’espressione di recoverin è stata riscontrata in circa il 68% dei pazienti con diversi sottotipi di RCC e oncocitoma, correlando positivamente con la dimensione del tumore [82]. È stato inoltre dimostrato che l’espressione di recoverin in alcuni tumori è mediata dalla demetilazione di alcune isole CpG nella regione del gene di recoverin sovrapposta al promotore a monte del primo esone e del primo esone stesso [59]. Coerentemente, è stato trovato che fino al 86% dei campioni di tumore renale con CpG demetilati in quella regione erano positivi per recoverin. È importante sottolineare che la metilazione del promotore di recoverin in posizione -80 è correlata positivamente alla OS dei pazienti esaminati [82]. Nell’insieme questi dati definiscono recoverin come il primo antigene onconeurale con un potenziale ruolo di marker diagnostico e/o prognostico per il tumore renale, se usato da solo o in combinazione con altri biomarcatori.

 

Inibitori PD-1/PD-L1

Attualmente, uno dei principali obiettivi è lo sviluppo di agenti che stimolino la risposta immunitaria contro i tumori. Programmed Death-1 (PD-1) è un recettore che si trova sulla superficie dei linfociti T attivati ed ha un ruolo fisiologicamente importante nei meccanismi che regolano l’autoimmunità, in quanto capace di legare le proteine di superficie PD-L1 e PD-L2, sopprimendo la risposta immunitaria contro gli antigeni self. Molte cellule tumorali, esprimendo sulla loro superficie PD-L1, creano un microambiente che neutralizza l’azione del sistema immunitario.

Gli inibitori PD-1/PD-L1 impediscono farmacologicamente l’interazione PD-1/PD-L1, facilitando così una risposta immunitaria positiva contro il tumore; tuttavia, non tutti i tumori che esprimono PD-L1 rispondono agli inibitori, così come è stato osservato che i tumori PD-L1 negativi possono rispondere a questi agenti [83]. Sono in fase di studio e sperimentazione diverse combinazioni di inibitori del checkpoint immunitario e agenti antiangiogenici. Tra questi è opportuno citare Nivolumab, un anticorpo monoclonale anti-PD-1 che, in combinazione all’anticorpo monoclonale anti-CTLA4 Ipilimumab, è stato autorizzato dall’EMA nel gennaio 2019 per il trattamento in prima linea del RCC in pazienti che non siano stati precedentemente trattati e che siano a rischio moderato o elevato di peggioramento. La scelta deriva dai risultati di uno studio in fase 3, CheckMate 214, che ha dimostrato come la combinazione di questi due farmaci, rispetto all’utilizzo di Sunitinib, migliori notevolmente la PFS tra i pazienti che hanno un’espressione di PD-L1 >1% (22,8 mesi vs 5,9 mesi) [84].

 

Conclusioni

Il RCC è tuttora considerato una delle neoplasie urologiche più sfavorevoli in termini di prognosi. Inoltre, l’assenza di sintomi rilevabili nelle fasi iniziali della malattia ne rende difficile la diagnosi precoce. Sebbene negli ultimi anni numerosi studi abbiano portato all’identificazione di diversi biomarcatori di RCC, la loro efficacia è ancora oggetto di discussione. Pertanto, non esistono di fatto biomarcatori validati per la diagnosi precoce di neoplasie renali, dal momento che quelli ad oggi disponibili non presentano sufficiente specificità e sensibilità. Al contrario, sono state proposte diverse combinazioni di markers sia a scopo diagnostico che per differenziare i sottotipi di RCC. Inoltre, un gran numero di biomarcatori di RCC prognostici e predittivi di risposta alla terapia rendono possibile monitorare la malattia e prevederne le principali caratteristiche clinico-patologiche (rischio di recidiva, metastasi, sopravvivenza, efficacia della terapia, ecc.) prima del trattamento, dopo l’intervento chirurgico, o durante la chemioterapia, anche a seguito dell’utilizzo dei nuovi farmaci ‘targeted’. Tuttavia, nonostante i recenti progressi in questo campo, sono necessari ulteriori studi al fine di accumulare più dati clinici per i marcatori di RCC esistenti, di ricercare nuovi antigeni e di evidenziare nuove correlazioni per ottenere diagnosi più accurate. Inoltre, la comprensione del ruolo patogenetico nello sviluppo della neoplasia di alcune nuove proteine identificate come biomarcatori di RCC rappresenta un campo di indagine molto promettente, non solo per migliorare le nostre potenzialità diagnostiche ma anche per sviluppare nuove strategie terapeutiche per il RCC.

 

 

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