HIF-ɑ: New Target For Treatment of Renal Anemia. Molecular Aspects and Activation of Pathway HREs

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Introduzione

Il fattore inducibile dell’ipossia (HIF), antico sistema biologico con lo scopo di proteggere l’organismo dai danni dell’ipossia acuta e cronica, è il regolatore chiave della risposta alle variazioni della pressione parziale dell’ossigeno nel sangue dei mammiferi [1]. L’omeostasi dell’ossigeno è fondamentale per il corretto sviluppo nelle varie fasi della vita: dalla gestazione intrauterina (una bassa tensione di ossigeno durante lo sviluppo embrionale e fetale è essenziale per processi come vasculogenesi e angiogenesi) alla vita adulta [2]. La proteina HIF è un fattore di trascrizione elica-loop-elica, molecola eterodimero costituita da una subunità ɑ ossigeno sensitiva e una subunità ß costitutiva chiamata anche idrocarburo arilico traslocatore nucleare del recettore (ARNT) [3]. L’attività di HIF-ɑ è direttamente regolata dal dominio strutturale della prolil-idrossilasi  (PHD), un enzima sensibile alle variazioni di ossigeno [4]. Sono stati identificati 3 isoforme di PHD: PHD1, PHD2, PHD3, e 3 di HIF-ɑ: HIF-1α (826 aa), HIF-2α (870 aa), HIF-3α (557 aa) e un solo sottotipo di HIF-β (789 aa) [5]. HIF-1α e HIF-2α presentano una similitudine del 85%. La struttura di HIF-ɑ è caratterizzata dalla presenza di domini: bHLH e PAS, presenti in tutte le isoforme, responsabili dell’interazione con il DNA, N-TAD e C-TAD, chiamati anche domini ODDD (degradazione ossigeno-dipendente) fondamentali per l’espressione di geni in risposta all’ipossia [6, 7]. HIF-3ɑ non esprime il dominio C-TAD (essenziale per corretto riconoscimento con il complesso di trascrizione P300/CBP), per tale motivo sembra non essere coinvolto in nessun processo trascrizionale (figura 1) [8].

Se i livelli di ossigeno sono normali, HIF-ɑ è continuamente degradata attraverso 2 vie: funzionale e conformazionale [9]. In condizioni di normossia, la PHD è responsabile della idrossilazione del dominio ODDD della prolina 402, 564 e 803 (HIF-1ɑ) e della prolina 405, 531 e 851 (HIF-2ɑ), impedendo il legame al coattivatore trascrizionale p300/CBP, essenziale per il riconoscimento delle sequenze HREs (elementi di risposta all’ipossia) sul DNA da parte della polimerasi (via funzionale) [10]. L’idrossilazione delle proline determina un cambiamento conformazionale di HIF-ɑ tale da essere riconosciuta dalla proteina pVHL (von Hippel-Lindau) in complesso con elonghina B, C e ubiquitina (via conformazionale) [11]. L’ubiquitinazione così ottenuta, sarà responsabile della degradazione proteasomica di HIF-ɑ (il tempo stimato per la sua completa degradazione è di 5 minuti) (figura 2a) [12].  In caso di ipossia, le idrossilasi non funzioneranno, i domini ODDD della subunità ɑ non verranno idrossilate, HIF-ɑ si accumulerà nel citoplasma, formerà un dimero con HIF-β, tale complesso deve essere stabilizzato dal coattivatore trascrizionale p300/CBP, il quale funziona come un ponte proteico tra HIF-ɑ e HIF-β [13]. Il complesso così formato HIFɑ/HIFβ/p300/CBP può traslocare nel nucleo interagendo con le sequenze HREs [14]. I geni target si dividono in quelli regolati dalla prolil-idrossilasi sulla porzione N-TAD e quelli regolati dal fattore inibente FIH sulla porzione finale C-TAD [15]. In caso di ipossia moderata è inibita solamente l’attività della PHD, verranno così espressi solamente i geni dell’N terminale del dominio N-TAD (figura 2b), in caso di ipossia grave verrà inibito anche FIH, con espressione dei geni sulla porzione C-TAD (figura 2c) [16]. HIF-1ɑ (regolata principalmente dalla PHD2), viene espressa in quasi tutti i tipi di cellule, attivando la trascrizione di numerosi geni coinvolti in diversi processi metabolici (lipidi, metabolismo mitocondriale ed energetico) e fisiologici (angiogenesi e infiammazione) [17]. HIF-2ɑ, regolata dalla PHD1, PHD2 e PHD3, viene espressa in un gruppo limitato di cellule (principalmente renali ed epatiche), influenza principalmente la trascrizione dei geni coinvolti nell’eritropoiesi, stimolando la produzione di eritropoietina endogena, incluse le proteine coinvolte nel trasporto del ferro [18]. Il ruolo della HIF 3ɑ non è stato ancora chiarito [19].

 

Effetti di HIF-ɑ sulla regolazione dell’espressione del gene dell’eritropoietina (EPO)

EPO è un ormone glicoproteico, prodotto principalmente dalle cellule interstiziali del rene e in misura minore dal fegato e dal cervello [20]. Una volta rilasciato nel sangue, raggiunge il midollo osseo dove esplica la sua funzione di promotore di proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici degli eritroblasti fino alla formazione di eritrociti maturi [21–23]. L’ipossia rappresenta il maggiore stimolo alla increzione di EPO attraverso la stabilizzazione di HIF-2ɑ dovuta da inibizione della PHD2. HIF-2ɑ, risulta espresso nelle cellule endoteliali, interstiziali, glomerulari del rene e negli epatociti, svolgendo un ruolo importante nella produzione di eritropoietina endogena [24]. A conferma di ciò, studi su modelli animali, mediante tecnica di delezione molecolare, hanno dimostrato lo sviluppo di una grave eritrocitosi con un aumento di 10 volte della concentrazione di EPO nel plasma sanguigno in topi Knockout per il gene PHD2 rispetto ai topi wild type [25]. Negli umani, è stata osservata una selezione positiva del polimorfismo adattativo per ridotta attività di PHD2, responsabile di una maggiore espressione di HIF-2ɑ, in popolazioni che vivono ad alta quota, come i tibetani e gli andini, rispetto a coloro che vivono in pianura [26]. L’inibizione della prolina idrossilasi (PHD2) favorisce la formazione del complesso HIF-2ɑ/HIF-β/p300/CBP, il quale ha bisogno della cooperazione funzionale di altri 2 fattori trascrizionali: HNF-4 (fattore nucleare tessuto specifico espresso sia nelle cellule epatiche che renali) e il fattore Sp1 (fattore di trascrizione ubiquitario) [27–29]. Il complesso così formato permette il corretto riconoscimento delle sequenze HREs per una regolazione tessuto specifica epato-renale di EPO (figura 3a).  A conferma di ciò, è stato dimostrato che mutazioni non senso a carico di HNF-4 e Sp1 inibiscono l’induzione di EPO in condizioni ipossiche [30]. Questi studi confermano il ruolo di HIF-2ɑ nella sintesi di eritropoietina epatica, che rappresenta la principale fonte di EPO durante lo sviluppo embrionale [31]. Sebbene il fegato non contribuisca al mantenimento dei livelli di EPO negli adulti, la sintesi di EPO dal tessuto epatico può essere riattivata in condizioni di ipossia moderata o grave [32]. Inoltre, è stato osservato che una frazione significativa di EPO deriverebbe proprio dal fegato a seguito di inibizione reversibile non ipossica di PHD2, in soggetti adulti affetti da malattia renale cronica terminale in trattamento emodialitico (con significativa degradazione del parenchima renale) oppure in pazienti nefrectomizzati [33, 34].

 

Effetti di HIF-ɑ sul metabolismo del ferro

HIF-ɑ coordina l’eritropoiesi influenzando anche il metabolismo del ferro attraverso l’assorbimento e il suo trasporto [35]. L’inibizione di PHD stabilizza il complesso HIF-2ɑ/HIF-β/p300/CBP, il quale ha bisogno della cooperazione delle proteine regolatrici del ferro (IRP), responsabili dell’espressione dei geni della regione 5′ dell’esone HRE, coinvolti nel trasporto e riassorbimento del ferro (figura 3b) [36]. Recenti studi dimostrano che HIF-2ɑ incrementa la trascrizione del citocromo b duodenale (DCYTB), enzima ferrico reduttasi sito nell’orletto a spazzola della superficie luminale degli enterociti che riduce Fe3+ (ferro ferrico) in Fe2+ (ferro ferroso), del trasportatore di metallo bivalente (DMT1), responsabile dell’assorbimento del ferro nella forma ferrosa [37]. Inoltre, aumenta l’espressione della ceruloplasmina, responsabile non solo dell’ossidazione del ferro ma anche coinvolta nel metabolismo del rame, eme-ossigenasi-1, implicato nel riciclare il ferro proveniente da eritrociti fagocitati, ferroportina (FPN) unico noto esportatore di ferro cellulare, transferrina, che trasporta il ferro nella sua forma ferrica (Fe3+) nel sangue, infine il recettore della transferrina TFR1 [38–41].

L’FPN è il bersaglio di degradazione da parte dell’epcidina, un piccolo peptide di 25 aminoacidi, prodotto dagli epatociti. L’espressione dell’epcidina è indotta da eccessi di ferro e citochine infiammatorie, mentre viene repressa da anemia e ipossia. Poiché l’epcidina sopprime l’espressione della FPN, elevati livelli di epcidina sono responsabili di alterato rilascio di ferro dalle riserve interne [42]. Nei pazienti con insufficienza renale cronica avanzata, i livelli plasmatici di epcidina sono frequentemente aumentati contribuendo alla patogenesi dell’anemia renale da scarsa mobilizzazione di riserve marziali [43]. Con l’attivazione sistemica di HIF-2ɑ, si osserva una riduzione dei livelli epcidina nel fegato incrementando l’assorbimento del ferro e anche la sua mobilitazione [44]. Sebbene studi iniziali suggerissero un ruolo diretto di HIF-2ɑ sulla soppressione della trascrizione dell’epcidina, successive analisi su modelli murini dimostrerebbero che essa stessa sarebbe inibita dall’eritroferrone, ormone proteico, prodotto dall’eritropoietina in risposta alla stimolazione EPO-mediata da HIF-2ɑ [45]. I risultati dello studio di Liu e collaboratori confermano quanto appena detto: in topi Knockout per HIF-2ɑ, la sola stabilizzazione di HIF-1ɑ non determina la soppressione di epcidina (Hamp1), viceversa, in topi Knockout per HIF-1ɑ, l’attivazione di HIF-2ɑ, con relativa induzione di EPO, è associata alla downregolation dell’espressione di Hamp1. Infine, nei topi sottoposti a sola inibizione farmacologica di EPO, nonostante l’attivazione di HIF-2ɑ, non si assiste alla soppressione dell’epcidina [46]. ERFE potenzia l’attività della ferroportina, aumentando l’assorbimento di ferro dall’intestino e la sua mobilitazione dai depositi per la sintesi dell’emoglobina, per cui HIF-2ɑ non agisce come un diretto repressore della trascrizione dell’epcidina epatica (figura 3c) [47].

 

Effetti di HIF-ɑ sul metabolismo dei lipidi

Il metabolismo del colesterolo è regolato dal 3-idrossi-3-metilglutaril-CoA-reduttasi (HMG-CoA reduttasi), un enzima limitante la biosintesi del colesterolo [48]. La sintesi del colesterolo è un processo che consuma molto ossigeno: 11 molecole di ossigeno per 1 molecola di colesterolo prodotto [49]. Di conseguenza, la privazione dell’ossigeno (ipossia) limita la sintesi del colesterolo, attraverso meccanismi non completamente compresi, coinvolgendo HIF-1ɑ che stimola la trascrizione del gene INSIG-2 [50]. La proteina Insig-2 si lega a HMG-CoA reduttasi e innesca la sua ubiquitazione e degradazione accelerata, contribuendo a una significativa riduzione della colesterolemia totale (figura 4a). Si tratta dunque di un processo fisiologico feedback negativo controllato, per proteggere la cellula dal consumo dispendioso di ossigeno durante l’ipossia [51]. Recenti studi hanno dimostrato che HIF-2ɑ interferisce con l’attività dei recettori scavenger SR-B1 attenuando così la degradazione di colesterolo HDL, contribuendo ad aumenti del colesterolo HDL ematico [52]. Numerosi dati confermano una riduzione significativa della trigliceridemia secondaria al trattamento con Roxadustat [53]. Un ruolo chiave nella biosintesi dei lipidi è svolto dalle lipine, una famiglia di proteine con attività fosfatidato fosfatasi Mg2+-dipendente (PAP1) che catalizzano la conversione dell’acido fosfatidico (PA) in diacilglicerolo (DAG) nella penultima fase della sintesi dei trigliceridi [54]. Il gene della lipina 1 è direttamente controllato da HIF-1ɑ e la sua up-regulation è correlata all’accumulo intracellulare dei trigliceridi, contribuendo così alla loro riduzione ematica, suggerendo che la lipina 1 è un importante mediatore dell’adattamento metabolico cellulare in risposta all’ipossia (figura 4 b) [55]. È noto che l’esposizione delle cellule a lieve ipossia comporta a una limitazione di nutrienti, la cellula dunque si difende, immagazzinando glucosio per un uso successivo come fonte di energia anaerobica [56]. Al contrario, i lipidi possono produrre energia solo attraverso la fosforilazione ossidativa, un processo drasticamente inibito da una grave ipossia. L’immagazzinamento dei trigliceridi sotto forma di goccioline lipidiche in condizioni di ipossia, potrebbe essere interpretata come una possibile risposta cellulare per tamponare la tossicità causata dall’ accumulo di prodotti derivanti dalla glicolisi anaerobica [57, 58]. Questi risultati indicano che la stabilizzazione di HIF-ɑ potrebbe essere sfruttata per futuri trattamenti terapeutici come la steatosi epatica secondaria a severa dislipidemia e nella prevenzione di malattie cardiovascolari [59].

 

Effetti di HIF-ɑ sulla fibrosi renale e polmonare

Il trattamento della fibrosi tissutale, presente nella maggior parte delle malattie croniche, rimane tutt’ora impegnativo. Numerosi studi su modelli animali hanno confermato l’influenza di HIF-ɑ nei confronti di processi molecolari responsabili della fibrosi renale e polmonare [60]. Diversi lavori suggeriscono che l’attivazione di HIF-α per brevi periodi possa contribuire a rallentare l’evoluzione della fibrosi renale in modelli animali sottoposti a nefrectomia subtotale [61]. Xue Li e collaboratori, hanno riportato dati che confermano il ruolo di Roxadustat nell’attivare il fattore nucleare eritroide 2 (Nrf2) [62]. Nrf2 è un importante regolatore della sequenza promotrice ARE, nota come elemento di risposta antiossidante che codifica l’espressione di enzimi antiossidanti e detossificanti [63]. Quando Nrf2 è inattivo, non compie nessuna azione poiché interagisce con la proteina Keap1 per essere degradata rapidamente, attraverso il sistema di ubiquitinazione (figura 5 a) [64]. La presenza di specie reattive dell’ossigeno (ROS), peculiari dello stress ossidativo, l’inibizione non ipossica della PHD, attivano la proteina Nrf2, la quale si dissocia da Keap1, per essere fosforilata e trasportata nel nucleo, ove si combina con la proteina Maf per formare un dimero che legandosi alla sequenza ARE avvia alla risposta antiossidante caratterizzata non solo dalla riduzione della sintesi di proteine profibrotiche quali la fibronectina, collagene IV, vimentina, ma anche da un aumento della concentrazione del complesso proteico AKt/GSK-3β, responsabile della inibizione della ferroptosi e infiammazione (figura 5b) [65]. Lo stress ossidativo e l’infiammazione sono caratteristiche comuni nella malattia renale cronica (CKD), per tale motivo gli inibitori HIF-ɑ potrebbero avere un ruolo protettivo nei confronti della fibrosi renale oltre alla correzione dell’anemia. Sono disponibili in letteratura diversi lavori che cercano di chiarire il ruolo protettivo di Roxadustat nei confronti della progressione della fibrosi polmonare. Recenti dati dimostrano che Roxadustat inibisce l’espressione della proteina segnale intracellulare p-Smad3 responsabile dell’attivazione del fattore di crescita profibrotico TGF-β1 [66]. Il complesso TGF β1/Smad3 attiva l’espressione di geni profibrotici quali collegene I e III, ɑ SMA (alpha-smooth muscle actin), Ctgf che sono responsabili della progressione della fibrosi polmonare (figura 5 c) [67].

 

Effetti di HIF-ɑ sull’infiammazione

L’infiammazione è una risposta di difesa, ma la sua persistenza si trasforma in patologia. Kiers nel 2016 ha documentato che la stabilizzazione di HIF-1ɑ è associata a una downregulation della concentrazione di proteine deputate alla risposta infiammatoria, ipotizzando un possibile ruolo terapeutico dell’ipossia in pazienti con sepsi ricoverati in terapia intensiva [68]. Gli effetti anti-infiammatori sarebbero dovuti dall’attivazione della pathway dell’adenosina [69]. L’adenosina è un nucleoside ad attività paracrina e autocrina coinvolta non solo nei processi metabolici cellulari, ma anche nella risposta immunitaria, rappresentando un importante meccanismo endogeno di protezione tissutale dall’infiammazione. L’idrolisi dei nucleotodiadeninici (ATP, ADP e AMP) ad adenosina avviene ad opera di due ectoenzimi: ecto-apirasi (CD 39) e la ecto-nucleotidasi (CD-73), la loro espressione è direttamente controllata da HIF-1ɑ (figura 6a) [70]. Successivi studi confermano il ruolo protettivo della stabilizzazione di HIF-1ɑ nei confronti del danno da ischemia-riperfusione nella muscolatura scheletrica nei ratti [71]. Li e collaboratori hanno identificato diversi specifici fattori trascrizionali che, interagendo con HIF-2ɑ, inibiscono l’espressione della CPT1A (carnitina-palmitoiltransferasi), enzima responsabile dell’ossidazione mitocondriale degli acidi grassi a catena lunga nel fegato e nel rene, il quale enzima secondo gli autori avrebbe un controllo diretto sull’attivazione dell’inflammasoma, a sua volta responsabile dell’attivazione della cascata infiammatoria (figura 6b) [72]. Infine, Hanet al. hanno dimostrato che il Roxadustat ha ridotto in modo significativo il danno polmonare acuto da sepsi in vivo e in vitro su modelli animali, grazie alla stabilizzazione di HIF-1α. I topi knockout per HIF-1α presentavano un minore tasso di sopravvivenza e aumentata espressione di fattori infiammatori rispetto ai topi che mostravano una up regolazione di HIF-1ɑ [73]. Tuttavia, non c’è un consenso unanime sulla funzione antinfiammatoria dell’HIF-ɑ. Kerber et al. riportano dati che a differenza di quanto citato in precedenza, HIF-1α e HIF-2α svolgerebbero ruoli opposti nella risposta antiinfiammatoria sulla colite acuta sperimentale in modelli murini: HIF-1α potenzia la risposta infiammatoria mentre HIF-2α la deprime [74]. Yamaguchi et al. forniscono interessanti dettagli molecolari di una possibile interazione bidirezionale tra infiammazione e stabilizzazione di HIF-1ɑ. Secondo gli autori, l’infiammazione stimolerebbe i macrofagi a rilasciare IL 1β che induce  l’espressione della proteina CEBPD (enhancer-binding protein)  nelle cellule tubulari renali attraverso la pathway di NF-kB (NuclearFactor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), in reni ipossici sia acuti che cronici aumentando la trascrizione di HIF-1α che a sua volta mantiene elevati i livelli di interleuchine pro infiammatorie (figura 6c). Questo studio fornisce le prove che, oltre all’ipossia, ci sarebbero altri fattori in grado di stabilizzare HIF-ɑ [75].

 

Conclusioni

I dati disponibili in letteratura forniscono evidenti prove che i benefici della stabilizzazione di HIF-ɑ da parte di Roxadustat vanno oltre la correzione dell’anemia.  Tuttavia, bisogna considerare che HIF-ɑ ha come bersaglio molti geni associati ad un’ampia risposta dovuta non solo dalle isoforme di HIF, ma anche dalle differenti linee cellulari considerate. Sono quindi necessari ulteriori studi per monitorare rigorosamente l’entità e la durata dell’attivazione di HIF-ɑ per evitare possibili effetti collaterali inattesi.

 

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