Approccio pratico alla terapia del paziente affetto da Rene Policistico Autosomico Dominante

Abstract

Il Rene Policistico Autosomico Dominante (ADPKD) è la più frequente patologia genetica di interesse nefrologico e coinvolge dal 7 al 10% dei soggetti in trattamento sostitutivo renale. Si stima che un numero compreso tra 24.000 e 34.000 soggetti in Italia siano affetti da questa condizione. In una patologia che è stata a lungo negletta per mancanza di opzioni terapeutiche è ora disponibile una attraente possibilità di trattamento: tolvaptan ha dimostrato in due trial clinici (pazienti ADPKD con insufficienza renale precoce e pazienti ADPKD con insufficienza renale avanzata) una efficacia clinica nel rallentare la progressione di malattia. La possibile tossicità epatica espressa in circa il 4% dei soggetti esposti al farmaco e un importante effetto acquaretico suggeriscono prudenza e attenzione nell’utilizzo di questa nuova molecola. Sulla base di queste criticità, alcuni medici con una diretta esperienza nell’uso del farmaco hanno brevemente raccolto nelle pagine a seguire le principali raccomandazioni cliniche al trattamento dei pazienti ADPKD. Le raccomandazioni riguardano l’approccio generale al paziente affetto da ADPKD ma con una attenzione particolare agli aspetti legati al nuovo trattamento. Sarà approfondito il delicato compito di introdurre al paziente le opportunità e i limiti della terapia offerta. Infine il documento vuole suggerire come meglio organizzare un ambulatorio dedicato a questa condizione.

Parole chiave: Rene Policistico Autosomico Dominante, insufficienza renale, cisti, aneurismi, tolvaptan

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INTRODUZIONE

Riccardo Magistroni

 

Il Rene Policistico Autosomico Dominante (ADPKD) è la più frequente patologia genetica di interesse nefrologico e coinvolge dal 7 al 10% dei soggetti in trattamento sostitutivo renale (13).

 

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Sequenziamento di Nuova Generazione: una valida strategia nella diagnosi molecolare di Rene Policistico

Abstract

L’ADPKD è la malattia genetica ereditaria più frequente al mondo causata da mutazioni del gene PKD1 nell’85% dei casi e da PKD2 nel restante 15%. Sebbene la diagnosi sia generalmente ottenuta attraverso ecografia, RMN e TC, alcune condizioni rendono lo studio genetico strettamente necessario come fenotipo clinico non tipico, casi senza familiarità, donazione da consanguinei. Purtroppo la presenza di pseudogeni in PKD1, la grandezza del gene, i costi del sequenziamento Sanger e l’eterogeneità genetica alla base delle patologie renali rendono particolarmente difficile l’analisi genetica. Il Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS) ha rivoluzionato la diagnosi molecolare delle patologie cistiche renali ereditarie grazie alla possibilità di analizzare contemporaneamente più geni. A tale proposito, abbiamo sviluppato una piattaforma NGS, chiamata Nephroplex, con lo scopo di identificare variazioni esoniche in 115 geni, responsabili di numerose patologie renali, comprese malattie cistiche e policistiche, ottenendo, complessivamente, una regione target di 338.8 kbp. La tecnologia utilizzata per l’arricchimento è il sistema HaloPlex, basata sulla digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione e la cattura delle regioni d’interesse con specifiche sonde d’ibridazione. Con la nostra piattaforma, abbiamo, dunque, analizzato 9 pazienti con diagnosi clinica di ADPKD. Abbiamo ottenuto un coverage depth di 100x per il 96.5% del target, mentre la regione non coperta rappresentava solo il 3% della regione di interesse. In 6 pazienti, abbiamo riscontrato mutazioni causative nei geni PKD1 e PKD2, ottenendo una detection rate del 66%. In conclusione, la piattaforma NephroPlex è un ottimo tool per la diagnosi molecolare di patologie renali e potrebbe chiarire i meccanismi alla base dell’eterogeneità genetica riscontrata nelle nefropatie

Parole chiave: Sequenziamento di Nuova Generazione, rene policistico, malattie genetiche

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Introduzione

 

1. Caratteristiche Cliniche della Malattia Policistica Renale Autosomica Dominante (ADPKD)

La Malattia Policistica Renale Autosomica Dominante dell’adulto (ADPKD), è la più comune tra le nefropatie cistiche ereditarie con una prevalenza stimata di 1:400-1:1000, ed è una delle più frequenti malattie monogeniche (1). È caratterizzata dalla progressiva sostituzione del parenchima renale funzionale con multiple cisti di origine tubulare. Ciò comporta progressivo aumento del volume renale associato al potenziale rischio di infezione ed emorragia delle cisti, nefrolitiasi, dolore, riduzione del GFR con evoluzione verso l’ESRD richiedente trattamento emodialitico e trapianto in circa il 10% della popolazione mondiale (12). La formazione di cisti può interessare anche altri organi quali fegato (70%) e pancreas (5-10%) in primis (3), ma anche milza, tiroide, aracnoide, vescicole seminali e prostata (4). Manifestazioni non cistiche includono: ipertensione arteriosa (70-80%), ernie addominali, anomalie delle valvole cardiache (25%) e anomalie vascolari intracraniche, compresi gli aneurismi (8%). La rottura degli aneurismi cerebrali rappresenta un’importante complicanza dell’ADPKD associata a grave morbidità e mortalità e si presenta in circa 1/2000 persone l’anno con un incidenza 5 volte maggiore rispetto alla popolazione generale (5,6). Il Rene Policistico autosomico dominante è causato da mutazioni del gene PKD1 (85% dei casi) e del gene PKD2 (15% dei casi) (7). Questi due geni codificano, rispettivamente, per la Policistina 1 e la Policistina 2,  proteine costituenti una sottofamiglia (TRPP) dei transient receptor potential (TRP) channel (8). Sono state proposte diverse localizzazioni delle Policistine, incluso il reticolo endoplasmatico (dove è maggiormente localizzata la policistina 2), membrana apicale e basolaterale o esosomi (9,10,11), anche se la localizzazione a livello del ciglio primario sembra essere il maggior determinante di malattia (12). Il gene PKD1 è costituito da 46 esoni e la regione compresa tra gli esoni 1 e 33 si caratterizza per la presenza di ben 6 pseudogeni, ossia copie geniche non funzionali (13). Le mutazioni responsabili del rene policistico interessano tutta l’estensione del gene e rappresentano mutazioni inattivanti.

2. Diagnosi di ADPKD

La diagnosi dell’ADPKD negli adulti è tipicamente basata sul riscontro di reni policistici bilateralmente ingranditi in ecografia (14). Per individui a rischio di ADPKD (familiari di primo grado di un soggetto affetto) sono stati proposti e revisionati criteri per migliorare la performance diagnostica dell’ecografia: la presenza di almeno 3 cisti renali (unilaterali o bilaterali) e di due cisti in ogni rene è sufficiente per la diagnosi in individui a rischio di età rispettivamente compresa tra 15-39 anni e 40-59 anni. Per individui di età superiore ai 60 anni sono richieste 4 o più cisti in ogni rene (15). TC e RMN sono utilizzate quando si necessita di informazioni in più sulla struttura e funzione renale, in presenza di casi equivoci, o quando la risoluzione dell’ecografia è scarsa (14). La diagnosi genetica, invece, non viene eseguita di routine soprattutto a causa dei costi elevati e delle difficoltà connesse alle metodiche di sequenziamento. Esistono tuttavia delle condizioni in cui l’indagine molecolare si rende strettamente necessaria:

  • Quando è richiesta una diagnosi definitiva in individui giovani, come nel caso di potenziali donatori viventi con diagnostica strumentale equivoca in famiglie con storia di ADPKD
  • In famiglie con diagnosi precoce di ADPKD, dal momento che in questi casi potrebbero essere coinvolti alleli ipomorfici o eredità oligogenica (16, 17)
  • In caso di necessità di consulenza genetica, soprattutto per le coppie che richiedono una diagnosi pre-impianto (18)
  • In pazienti con storia familiare negativa per ADPKD, a causa del potenziale overlap fenotipico con altre patologie, come per esempio, fenocopie di ADPKD che derivano invece da mutazioni in altri cistogeni noti quali HNF1β, PRKCSH,SEC63 (19,20,21) o PKHD1 (22), che possono tener conto della malattia in alcuni individui, o per il coinvolgimento di geni che tipicamente causano altre ciliopatie con manifestazioni extrarenali, come la nefronoftisi (NPH) e la sindrome di Barted-Biedl (BBS) che, in alcuni casi, possono mimare la malattia policistica, specialmente in epoca prenatale (23).

Al di là di queste indicazioni, il test genetico potrebbe avere grosse implicazioni nella diagnosi e  gestione dei pazienti con ADPKD (24), tenendo conto anche della possibilità di effettuare valutazioni prognostiche (per esempio il decorso clinico è più severo nei pazienti con mutazione in PKD1 che in PKD2, con età media di inizio dell’ESRD rispettivamente di 54.3 e 74 anni) (25). Inoltre, con lo sviluppo di nuove terapie potenzialmente efficaci per il trattamento dell’ADPKD, la necessità di accurati test genetici sta diventando ancora più convincente (26). Purtroppo l’analisi genetica è complicata, soprattutto a causa della complessa struttura genomica, specie in riferimento a PKD1, e dell’eterogeneità genetica e clinica. I test diagnostici convenzionali, infatti, prevedono una laboriosa amplificazione locus specifica mediante Long-Range PCR (LR-PCR), seguita dal sequenziamento Sanger, che richiede tempi lunghi e costi elevati (27). Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il campo della diagnostica genetica e molecolare e ha permesso il sequenziamento in parallelo di tutti i geni malattia che possono essere considerati in un dato paziente. A tale proposito, abbiamo sviluppato una piattaforma NGS, chiamata Nephroplex, con lo scopo di identificare variazioni esoniche in 115 geni, responsabili di numerose patologie renali, comprese malattie cistiche e policistiche, dimostrandone l’alta specificità e sensibilità.

 

Materiali e Metodi

 

Pazienti

Sono stati selezionati dal nostro database 9 pazienti con diagnosi clinica di ADPKD. Ciascun paziente ha prestato il proprio consenso informato al trattamento dei dati genetici in forma anonima per scopi scientifici. Per ogni soggetto sono stati raccolti 4 ml di sangue venoso periferico anticoagualto con EDTA. Il sangue raccolto è stato conservato a – 20° C fino al momento dell’utilizzo presso il dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale della Seconda Università degli Studi di Napoli. Il DNA è stato estratto seguendo le procedure standard.

Analisi NGS (Sequenziamento di nuova generazione)

Per lo sviluppo della piattaforma Nephroplex abbiamo selezionato 115 geni responsabili delle principali malattie renali cistiche e non cistiche comprese  la S. di Bardet Biedl, la S di Meckel, le Nefronoftisi, la Malattia cistica della Midollare, ottenendo, complessivamente, una regione target  di 338.8 kbp.  L’arricchimento è stato eseguito con la piattaforma Haloplex dell’Agilent e le librerie sono state sequenziate utilizzando la piattaforma HiSeq1000 system. Abbiamo ottenuto un coverage medio di 20X per il 98,8% del target e il 96.5% aveva una copertura 100X. In media, abbiamo identificato 205 varianti per ciascun paziente ed abbiamo selezionato le mutazioni non sinonime presenti nella popolazione generale con una frequenza inferiore all’1%. In questo modo, abbiamo ottenuto, in media, 11 variazioni per paziente.

 

Risultati

In 6 dei 9 pazienti con diagnosi clinica di rene policistico analizzati, abbiamo riscontrato mutazioni causative nei geni PKD1 e PKD2, ottenendo una detection rate del 66%. In particolare, abbiamo identificato 4 pazienti con mutazioni inattivanti nel gene PKD1 (3 mutazioni frameshift ed una non senso) e 2 pazienti con mutazioni frameshift nel gene PKD2. Le mutazioni identificate sono tutte nuove, mai descritte in letteratura.

Figura 1. Targeting  workflow

 

Discussione

In un lasso di tempo relativamente breve, il Sequenziamento di Nuova Generazione ha sostanzialmente rivoluzionato le potenzialità nel campo della diagnostica e della ricerca genomica. Alla luce di queste nuove potenzialità, il nostro studio si propone di indagare pazienti con ADPKD in maniera rapida e a costi contenuti. Inoltre, la possibilità di disporre di un pannello di 115 geni coinvolti in gran parte delle patologie renali (comprese quelle cistiche, policistiche e le ciliopatie) permette un inquadramento genetico globale del paziente policistico. In ciascuno dei nostri 9 pazienti, sono state identificate varianti in altri geni associati a patologia. Il significato clinico di queste variazioni resta, al momento, di difficile interpretazione. Tuttavia, la nostra piattaforma potrebbe chiarire i meccanismi genetici alla base dell’eterogeneità clinica del rene policistico e di tutte le patologie renali. Nonostante le dimensioni della nostra coorte siano modeste, i risultati sembrano molto incoraggianti grazie al buon coverage ottenuto che ha permesso di identificare mutazioni in molti geni con sensibilità comparabile a quella delle metodiche tradizionali di sequenziamento. Riguardo ai tre pazienti per cui l’analisi genetica non ha fornito alcun risultato, stiamo approfondendo l’indagine alla ricerca di mutazioni introniche profonde o di riarrangiamenti genomici complessi.

 

Conclusioni

In conclusione possiamo affermare che il nostro approccio è rapido, economico e incontra i criteri di sensibilità e specificità richiesti per la diagnostica molecolare e come tale è pronto a sostituire i classici metodi nella diagnostica genetica dell’ADPKD

 

Bibliografia

  1. Torres VE, Harris PC, Pirson Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 2007;369(9569):1287–1301.
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  24. Blumenfeld JD: Pretransplant genetic testing of live kidney donors at risk for autosomal dominant polycystic kidney disease. Transplantation 2009, 87:6e7
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Manifestazioni Renali del Rene Policistico Autosomico Dominante

Abstract

Il rene policistico colpisce oltre 12 milioni di individui nel mondo ed è la quarta causa di ESRD. E’ la principale malattia monogenica che colpisce il rene e determina la progressiva formazione di cisti che portano all’insufficienza renale dopo qualche decennio. Le principali manifestazioni della malattia si osservano anche in giovane età.
La prima manifestazione renale è rappresentata dal difetto di concentrazione urinaria dovuta sia all’alterazione della midollare da parte delle cisti sia ad una resistenza alla vasopressina. Queste alterazioni anatomiche determinano anche l’instaurarsi dell’iperfiltrazione, di un alterato trasporto dell’ammonio, di una predisposizione alla formazione di calcoli ma soprattutto alla comparsa di ipertensione arteriosa anche in età pediatrica. E’ stata dimostrata un’attivazione del sistema renina-angiotensina responsabile del mantenimento di elevati valori pressori nonché della crescita delle cisti e della fibrosi renale. L’ipertensione arteriosa sarebbe responsabile dell’ipertrofia ventricolare. Molti recenti studi hanno confermato il ruolo del controllo pressorio, soprattutto se rigoroso, nella riduzione della progressione della malattia renale e l’utilizzo degli ACE-inibitori sembrerebbe avere un’efficacia superiore agli altri farmaci antiipertensivi.
La progressione della malattia renale si evidenzia con la caduta del filtrato glomerulare che può essere minimo nei primi anni grazie all’iperfiltrazione ma in seguito può anche superare i 5 ml/min per anno soprattutto quando il volume renale totale (TKV) supera i 1500 ml.
Nelle forme a più rapida progressione l’ESRD può comparire intorno a 55 anni di età ed i principali fattori di rischio sono rappresentati dall’età, la mutazione genetica, la familiarità per ESRD, episodi di macroematuria e l’insorgenza di ipertensione in giovane età. Alcuni autori hanno proposto degli score sia genetici sia clinici che possono fornire indicazioni sulle probabilità di rapida progressione.
Altre manifestazioni della malattia sono il dolore renale, la nefrolitiasi, le infezioni delle vie urinarie e delle cisti. Il carcinoma renale è un evento molto raro.

PAROLE CHIAVE: rene policistico autosomico dominante dell’adulto, ipertensione arteriosa, sistema renina-angiotensina-aldosterone, iperfiltrazione compensatoria, volume renale, ESRD.

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Introduzione

Il rene policistico rappresenta la malattia ereditaria monogenica più frequente in ambito nefrologico. Ne sono affetti circa 12,5 milioni di individui nel mondo ed è la quarta causa di insufficienza renale terminale dopo il diabete, l’ipertensione e le glomerulonefriti (1). 

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