Supplemento S71 - Editoriali

Sequenziamento di Nuova Generazione: una valida strategia nella diagnosi molecolare di Rene Policistico

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Arianna Restivo1, Giuseppina Di Fruscio2, Cristina Masella1, Luca Rinaldi1, Giovanna Capolongo1, Ilaria Raiola1, Giovambattista Capasso1

1 Cattedra di Nefrologia, Seconda Università degli Studi di Napoli
2 Laboratorio di Genetica Medica, Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia generale, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli, Italy

Corrispondenza a:
Dott.ssa Arianna Restivo
Cattedra di Nefrologia, Università della Campania L. Vanvitelli
via Pansini n° 5, Nuovo Policlinico 80131 Napoli
Tel +39 0815667697. Fax +390815666652
E-mail: ariannarestivo@yahoo.it

Contributi agli autori: gli autori non hanno ricevuto sponsorizzazioni economiche per la preparazione dell’articolo, né per lo svolgimento dello studio
Studi Sperimentali su esseri umani: lo studio è stato condotto previa approvazione da parte del comitato etico

 

Abstract

L’ADPKD è la malattia genetica ereditaria più frequente al mondo causata da mutazioni del gene PKD1 nell’85% dei casi e da PKD2 nel restante 15%. Sebbene la diagnosi sia generalmente ottenuta attraverso ecografia, RMN e TC, alcune condizioni rendono lo studio genetico strettamente necessario come fenotipo clinico non tipico, casi senza familiarità, donazione da consanguinei. Purtroppo la presenza di pseudogeni in PKD1, la grandezza del gene, i costi del sequenziamento Sanger e l’eterogeneità genetica alla base delle patologie renali rendono particolarmente difficile l’analisi genetica. Il Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS) ha rivoluzionato la diagnosi molecolare delle patologie cistiche renali ereditarie grazie alla possibilità di analizzare contemporaneamente più geni. A tale proposito, abbiamo sviluppato una piattaforma NGS, chiamata Nephroplex, con lo scopo di identificare variazioni esoniche in 115 geni, responsabili di numerose patologie renali, comprese malattie cistiche e policistiche, ottenendo, complessivamente, una regione target di 338.8 kbp. La tecnologia utilizzata per l’arricchimento è il sistema HaloPlex, basata sulla digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione e la cattura delle regioni d’interesse con specifiche sonde d’ibridazione. Con la nostra piattaforma, abbiamo, dunque, analizzato 9 pazienti con diagnosi clinica di ADPKD. Abbiamo ottenuto un coverage depth di 100x per il 96.5% del target, mentre la regione non coperta rappresentava solo il 3% della regione di interesse. In 6 pazienti, abbiamo riscontrato mutazioni causative nei geni PKD1 e PKD2, ottenendo una detection rate del 66%. In conclusione, la piattaforma NephroPlex è un ottimo tool per la diagnosi molecolare di patologie renali e potrebbe chiarire i meccanismi alla base dell’eterogeneità genetica riscontrata nelle nefropatie

Parole chiave: Sequenziamento di Nuova Generazione, rene policistico, malattie genetiche

Introduzione

 

1. Caratteristiche Cliniche della Malattia Policistica Renale Autosomica Dominante (ADPKD)

La Malattia Policistica Renale Autosomica Dominante dell’adulto (ADPKD), è la più comune tra le nefropatie cistiche ereditarie con una prevalenza stimata di 1:400-1:1000, ed è una delle più frequenti malattie monogeniche (1). È caratterizzata dalla progressiva sostituzione del parenchima renale funzionale con multiple cisti di origine tubulare. Ciò comporta progressivo aumento del volume renale associato al potenziale rischio di infezione ed emorragia delle cisti, nefrolitiasi, dolore, riduzione del GFR con evoluzione verso l’ESRD richiedente trattamento emodialitico e trapianto in circa il 10% della popolazione mondiale (1–2). La formazione di cisti può interessare anche altri organi quali fegato (70%) e pancreas (5-10%) in primis (3), ma anche milza, tiroide, aracnoide, vescicole seminali e prostata (4). Manifestazioni non cistiche includono: ipertensione arteriosa (70-80%), ernie addominali, anomalie delle valvole cardiache (25%) e anomalie vascolari intracraniche, compresi gli aneurismi (8%). La rottura degli aneurismi cerebrali rappresenta un’importante complicanza dell’ADPKD associata a grave morbidità e mortalità e si presenta in circa 1/2000 persone l’anno con un incidenza 5 volte maggiore rispetto alla popolazione generale (5,6). Il Rene Policistico autosomico dominante è causato da mutazioni del gene PKD1 (85% dei casi) e del gene PKD2 (15% dei casi) (7). Questi due geni codificano, rispettivamente, per la Policistina 1 e la Policistina 2,  proteine costituenti una sottofamiglia (TRPP) dei transient receptor potential (TRP) channel (8). Sono state proposte diverse localizzazioni delle Policistine, incluso il reticolo endoplasmatico (dove è maggiormente localizzata la policistina 2), membrana apicale e basolaterale o esosomi (9,10,11), anche se la localizzazione a livello del ciglio primario sembra essere il maggior determinante di malattia (12). Il gene PKD1 è costituito da 46 esoni e la regione compresa tra gli esoni 1 e 33 si caratterizza per la presenza di ben 6 pseudogeni, ossia copie geniche non funzionali (13). Le mutazioni responsabili del rene policistico interessano tutta l’estensione del gene e rappresentano mutazioni inattivanti.

2. Diagnosi di ADPKD

La diagnosi dell’ADPKD negli adulti è tipicamente basata sul riscontro di reni policistici bilateralmente ingranditi in ecografia (14). Per individui a rischio di ADPKD (familiari di primo grado di un soggetto affetto) sono stati proposti e revisionati criteri per migliorare la performance diagnostica dell’ecografia: la presenza di almeno 3 cisti renali (unilaterali o bilaterali) e di due cisti in ogni rene è sufficiente per la diagnosi in individui a rischio di età rispettivamente compresa tra 15-39 anni e 40-59 anni. Per individui di età superiore ai 60 anni sono richieste 4 o più cisti in ogni rene (15). TC e RMN sono utilizzate quando si necessita di informazioni in più sulla struttura e funzione renale, in presenza di casi equivoci, o quando la risoluzione dell’ecografia è scarsa (14). La diagnosi genetica, invece, non viene eseguita di routine soprattutto a causa dei costi elevati e delle difficoltà connesse alle metodiche di sequenziamento. Esistono tuttavia delle condizioni in cui l’indagine molecolare si rende strettamente necessaria:

  • Quando è richiesta una diagnosi definitiva in individui giovani, come nel caso di potenziali donatori viventi con diagnostica strumentale equivoca in famiglie con storia di ADPKD
  • In famiglie con diagnosi precoce di ADPKD, dal momento che in questi casi potrebbero essere coinvolti alleli ipomorfici o eredità oligogenica (16, 17)
  • In caso di necessità di consulenza genetica, soprattutto per le coppie che richiedono una diagnosi pre-impianto (18)
  • In pazienti con storia familiare negativa per ADPKD, a causa del potenziale overlap fenotipico con altre patologie, come per esempio, fenocopie di ADPKD che derivano invece da mutazioni in altri cistogeni noti quali HNF1β, PRKCSH,SEC63 (19,20,21) o PKHD1 (22), che possono tener conto della malattia in alcuni individui, o per il coinvolgimento di geni che tipicamente causano altre ciliopatie con manifestazioni extrarenali, come la nefronoftisi (NPH) e la sindrome di Barted-Biedl (BBS) che, in alcuni casi, possono mimare la malattia policistica, specialmente in epoca prenatale (23).

Al di là di queste indicazioni, il test genetico potrebbe avere grosse implicazioni nella diagnosi e  gestione dei pazienti con ADPKD (24), tenendo conto anche della possibilità di effettuare valutazioni prognostiche (per esempio il decorso clinico è più severo nei pazienti con mutazione in PKD1 che in PKD2, con età media di inizio dell’ESRD rispettivamente di 54.3 e 74 anni) (25). Inoltre, con lo sviluppo di nuove terapie potenzialmente efficaci per il trattamento dell’ADPKD, la necessità di accurati test genetici sta diventando ancora più convincente (26). Purtroppo l’analisi genetica è complicata, soprattutto a causa della complessa struttura genomica, specie in riferimento a PKD1, e dell’eterogeneità genetica e clinica. I test diagnostici convenzionali, infatti, prevedono una laboriosa amplificazione locus specifica mediante Long-Range PCR (LR-PCR), seguita dal sequenziamento Sanger, che richiede tempi lunghi e costi elevati (27). Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il campo della diagnostica genetica e molecolare e ha permesso il sequenziamento in parallelo di tutti i geni malattia che possono essere considerati in un dato paziente. A tale proposito, abbiamo sviluppato una piattaforma NGS, chiamata Nephroplex, con lo scopo di identificare variazioni esoniche in 115 geni, responsabili di numerose patologie renali, comprese malattie cistiche e policistiche, dimostrandone l’alta specificità e sensibilità.

 

Materiali e Metodi

 

Pazienti

Sono stati selezionati dal nostro database 9 pazienti con diagnosi clinica di ADPKD. Ciascun paziente ha prestato il proprio consenso informato al trattamento dei dati genetici in forma anonima per scopi scientifici. Per ogni soggetto sono stati raccolti 4 ml di sangue venoso periferico anticoagualto con EDTA. Il sangue raccolto è stato conservato a – 20° C fino al momento dell’utilizzo presso il dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale della Seconda Università degli Studi di Napoli. Il DNA è stato estratto seguendo le procedure standard.

Analisi NGS (Sequenziamento di nuova generazione)

Per lo sviluppo della piattaforma Nephroplex abbiamo selezionato 115 geni responsabili delle principali malattie renali cistiche e non cistiche comprese  la S. di Bardet Biedl, la S di Meckel, le Nefronoftisi, la Malattia cistica della Midollare, ottenendo, complessivamente, una regione target  di 338.8 kbp.  L’arricchimento è stato eseguito con la piattaforma Haloplex dell’Agilent e le librerie sono state sequenziate utilizzando la piattaforma HiSeq1000 system. Abbiamo ottenuto un coverage medio di 20X per il 98,8% del target e il 96.5% aveva una copertura 100X. In media, abbiamo identificato 205 varianti per ciascun paziente ed abbiamo selezionato le mutazioni non sinonime presenti nella popolazione generale con una frequenza inferiore all’1%. In questo modo, abbiamo ottenuto, in media, 11 variazioni per paziente.

 

Risultati

In 6 dei 9 pazienti con diagnosi clinica di rene policistico analizzati, abbiamo riscontrato mutazioni causative nei geni PKD1 e PKD2, ottenendo una detection rate del 66%. In particolare, abbiamo identificato 4 pazienti con mutazioni inattivanti nel gene PKD1 (3 mutazioni frameshift ed una non senso) e 2 pazienti con mutazioni frameshift nel gene PKD2. Le mutazioni identificate sono tutte nuove, mai descritte in letteratura.

Figura 1. Targeting  workflow

 

Discussione

In un lasso di tempo relativamente breve, il Sequenziamento di Nuova Generazione ha sostanzialmente rivoluzionato le potenzialità nel campo della diagnostica e della ricerca genomica. Alla luce di queste nuove potenzialità, il nostro studio si propone di indagare pazienti con ADPKD in maniera rapida e a costi contenuti. Inoltre, la possibilità di disporre di un pannello di 115 geni coinvolti in gran parte delle patologie renali (comprese quelle cistiche, policistiche e le ciliopatie) permette un inquadramento genetico globale del paziente policistico. In ciascuno dei nostri 9 pazienti, sono state identificate varianti in altri geni associati a patologia. Il significato clinico di queste variazioni resta, al momento, di difficile interpretazione. Tuttavia, la nostra piattaforma potrebbe chiarire i meccanismi genetici alla base dell’eterogeneità clinica del rene policistico e di tutte le patologie renali. Nonostante le dimensioni della nostra coorte siano modeste, i risultati sembrano molto incoraggianti grazie al buon coverage ottenuto che ha permesso di identificare mutazioni in molti geni con sensibilità comparabile a quella delle metodiche tradizionali di sequenziamento. Riguardo ai tre pazienti per cui l’analisi genetica non ha fornito alcun risultato, stiamo approfondendo l’indagine alla ricerca di mutazioni introniche profonde o di riarrangiamenti genomici complessi.

 

Conclusioni

In conclusione possiamo affermare che il nostro approccio è rapido, economico e incontra i criteri di sensibilità e specificità richiesti per la diagnostica molecolare e come tale è pronto a sostituire i classici metodi nella diagnostica genetica dell’ADPKD

 

Bibliografia

  1. Torres VE, Harris PC, Pirson Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 2007;369(9569):1287–1301.
  2. Chapman AB, Bost JE, Torres VE et al. Kidney volume and functional outcomes in autosomal dominant polycystic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2012; 7: 479–486.
  3. Nicolau C, Torra R, Bianchi L et al: Abdominal sonographic study of autosomal dominant polycystic kidney disease. J Clin Ultrasound 2000; 28: 277–282.
  4. Danaci M, Akpolat T, Bastemir M et al: The prevalence of seminal vesicle cysts in autosomal dominant polycystic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 1998; 13: 2825– 2828
  5. Pirson Y, Chauveau D, Torres V: Management of cerebral aneurysms in autosomal dominant polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 269–276.
  6. Chauveau D, Pirson Y, Verellen-Dumoulin C, Macnicol A, Gonzalo A, Grunfeld JP: Intracranial aneurysms in autosomal dominant polycystic kidney disease. Kidney Int 1994; 45:1140– 1146.
  7. Barua M, Cil O, Paterson AD et al. Family history of renal disease severity predicts the mutated gene in ADPKD. J Am Soc Nephrol 2009; 20:1833–1838.
  8. Kottgen M. TRPP2 and autosomal dominant polycystic kidney disease. Biochim Biophys Acta 2007;1772:836–850. [PubMed: 17292589]
  9. Hogan MC, Manganelli L, Woollard JR et al. Characterization of PKD protein-positive exosome-like vesicles. J Am Soc Nephrol.2009;20(2):278–288.
  10. Scheffers MS, Le H, van der Bent P, et al. Distinct subcellular expression of endogenous polycystin-2 in the plasma membrane and Golgi apparatus of MDCK cells. Hum Mol Genet. 2002;11(1):59–67.
  11. Wilson PD. Polycystic kidney disease. N Engl J Med.2004;350(2):151–164.
  12. Hildebrandt F, Benzing T, Katsanis N. Ciliopathies. N Engl J Med. 2011;364(16):1533–1543.
  13. Loftus BJ, Kim UJ, Sneddon VP et al. Genome duplications and other features in 12 Mb of DNA sequence from human chromosome 16p and 16q. Genomics. 1999; 60:295–308. [PubMed: 10493829]
  14. Boucher C, Sandford R. Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD, MIM 173900, PKD1 and PKD2 genes, protein products known as polycystin-1 and polycystin-2) Eur J Hum Genet. 2004;12:347–354
  15. Pei Y, Obaji J, Dupuis A, et al. Unified criteria for ultrasonographic diagnosis of ADPKD. J Am Soc Nephrol 2009;20:205–212. [PubMed: 18945943]
  16. Rossetti S, Kubly VJ, Consugar MB et al. Incompletely penetrant PKD1 alleles suggest a role for gene dosage in cyst initiation in polycystic kidney disease. Kidney Int. 2009 Apr;75(8):848-55. doi: 10.1038/ki.2008.686. Epub 2009 Jan 21
  17. Cornec-Le Gall E1, Audrézet MP, Chen JM et al. Type of PKD1 mutation influences renal outcome in ADPKD. J Am Soc Nephrol. 2013 May;24(6):1006-13. doi: 10.1681/ASN.2012070650. Epub 2013 Feb 21
  18. Harris PC1, Rossetti S. Molecular diagnostics for autosomal dominant polycystic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 2010 Apr;6(4):197-206. doi: 10.1038/nrneph.2010.18. Epub 2010 Feb 23
  19. Heidet L, et al. Spectrum of HNF1B mutations in a cohort of patients harboring renal diseases [abstract]. J. Am. Soc. Nephrol. 2009; 20:773A.
  20. Davila S, Furu L, Gharavi AG et al. Mutations in SEC63 cause autosomal dominant polycystic liver disease. Nat. Genet.2004; 36:575–577. [PubMed: 15133510]
  21. Li A, Davila S, Furu L et al. Mutations in PRKCSH cause isolated autosomal dominant polycystic liver disease. Am. J. Hum. Genet. 2003; 72:691–703. [PubMed: 12529853]
  22. Adeva M, El-Youssef M, Rossetti S, et al. Clinical and molecular characterization defines a broadened spectrum of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD). Medicine. 2006; 85:1–21. [PubMed: 16523049]
  23. Bergmann C (2014) ARPKD and early manifestations of ADPKD: the original polycystic kidney disease and phenocopies. Pediatr Nephrol. PMID: 25543194
  24. Blumenfeld JD: Pretransplant genetic testing of live kidney donors at risk for autosomal dominant polycystic kidney disease. Transplantation 2009, 87:6e7
  25. Hateboer N, v Dijk MA, Bogdanova N et al. Comparison of phenotypes of polycystic kidney disease types 1 and 2. Lancet. 1999; 353:103–107. [PubMed: 10023895]
  26. Torres VE, Chapman AB, Devuyst O et al. Tolvaptan in patients with autosomal dominant polycystic kidney disease. N Engl J Med 2012, 367:2407e2418
  27. Rossetti S, Chauveau D, Walker D et al. A complete mutation screen of the ADPKD genes by DHPLC. Kidney Int 2002, 61:1588e1599