Marzo Aprile 2022

Lo stress ossidativo è ridotto in pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan

Abstract

La malattia renale policistica autosomica dominante (ADPKD) è la malattia renale monogenica più frequente e causa ipertensione arteriosa e malattia renale progressiva, entrambe legate allo stress ossidativo (OxSt). Il tolvaptan è una opzione di trattamento nota in ADPKD ma i meccanismi molecolari coinvolti non sono stati completamente chiariti. Questo studio valuta lo OxSt In 9 soggetti per gruppo attraverso: l’espressione proteica di p22phox, lo stato della fosforilazione di MYPT-1 (Western blot) e l’eme ossigenasi-1 (HO-1) (ELISA).

L’espressione proteica di p22phox era ridotta nei pazienti ADPKD trattati con tolvaptan e nei soggetti di controllo rispetto ai pazienti ADPKD non trattati: 0.86 ±0.15 d.u. p=0.015; 0.53 ±0.11, p<0.001; 1.42 ±0.11. Lo stesso si riscontrava per la fosforilazione di MYPT-1: 0.68 ±0.09, p=0.013, 0.47 ±0.13, p<0.001, 0.96 ±0.28 mentre HO-1 dei pazienti non trattati era ridotta sia rispetto ai controlli che ai pazienti trattati: 1.97 ±1.22, ng/mL, 2.08 ±0.79, p=0.012, 5.33 ±3.34, p=0.012. I pazienti ADPKD trattati con tolvaptan presentano una riduzione dello OxSt che potrebbe contribuire a rallentare la perdita di funzione renale. Parole chiave: tolvaptan, ADPKD, stress ossidativo, Rho chinasi

Introduzione

La malattia renale policistica autosomica dominante (ADPKD) è un disordine genetico caratterizzato dalla comparsa di multiple cisti renali e in altri organi, come il fegato, e colpisce 12,5 milioni di persone in tutto il mondo; si riscontra nel 10% dei pazienti affetti da insufficienza renale allo stadio terminale. L’ADPKD è caratterizzata dal progressivo sviluppo e crescita delle cisti con sovvertimento del parenchima renale, associato ad ipertensione, dolore addominale, sanguinamento delle cisti con macroematuria, nefrolitiasi, infezioni delle cisti [1].

La ADPKD è causata da mutazioni nei geni PKD1 (75-78% dei casi) o PKD2 (15%). PKD1, situato sul cromosoma 16 (16p13.3) codifica per la policistina-1 (PC1), una glicoproteina multidominio che viene scissa in un sito proteolitico del recettore accoppiato alla proteina G. PKD2, localizzato sul cromosoma 4 (4q21), codifica per la policistina-2 (PC2), una proteina appartenente alla famiglia dei canali cationici regolati dal calcio. Gli studi ora supportano un ruolo inibitorio di PC1 e PC2 sulla cistogenesi [2]. La perdita di PC1 o PC2 è infatti associata a basse concentrazioni di calcio intracellulare, che determina un aumento dell’attività dell’adenilciclasi e ridotta attività della fosfodiesterasi 1, ed eccessive concentrazioni di AMP ciclico (cAMP) e conseguente cistogenesi attraverso l’attivazione delle vie di proliferazione e secrezione [2].

Studi preclinici hanno dimostrato il ruolo del signaling di cAMP mediato da arginina-vasopressina come fattore determinante nell’ADPKD della proliferazione cistica e secrezione di liquidi. In modelli murini la soppressione di vasopressina, l’antagonismo del recettore V2 della vasopressina o il silenziamento della vasopressina hanno determinato un miglioramento del processo di aumento di volume delle cisti [3].

Tolvaptan, un’antagonista del recettore V2 della vasopressina, si è dimostrato efficace nel rallentare l’aumento del volume renale totale ed è ora una consolidata opzione di trattamento per i pazienti con ADPKD [4].

Lo stress ossidativo (OxSt), l’infiammazione e la disfunzione endoteliale hanno un ruolo chiave nell’induzione di aterogenesi, malnutrizione e anemia nei pazienti con malattia renale cronica; OxSt è uno dei principali fattori che contribuiscono alla progressione della malattia renale cronica (CKD) [5,6]. I pazienti con CKD hanno infatti un aumento di OxSt legato alla riduzione di antiossidanti e alla ridotta biodisponibilità dell’ossido nitrico (NO) [79].

Nell’ADPKD l’anomalia di PC1 o PC2 è stata associata ad una riduzione mediata dallo OxSt della biodisponibilità di NO con conseguente disfunzione endoteliale, insorgenza di ipertensione arteriosa e rimodellamento cardiovascolare che contribuiscono alla progressione dell’APDKD e della CKD [10]. L’associazione tra ADPKD e disfunzione endoteliale conseguente all’aumentato stress ossidativo è stata confermata [11] e markers di disfunzione endoteliale e di stress ossidativo sono risultati elevati in pazienti con ADPKD con funzione renale moderatamente ridotta ed associati al declino dell’eGFR [12]. Il sistema RhoA/Rho chinasi (ROCK) [10] svolge un ruolo chiave nell’induzione del signaling dello OxSt [5,13,14] e l’attivazione di questa pathway porta al rimodellamento cardiovascolare e renale, essenzialmente attraverso l’induzione di OxSt e la riduzione della biodisponibilità di NO [5,1315].

L’impatto di OxSt e l’effetto di tolvaptan su OxSt nell’ADPKD sono stati valutati in modelli animali o nell’uomo attraverso la determinazione di marcatori biochimici correlati a OxSt e all’infiammazione [1012] mentre non sono disponibili studi che valutino nell’uomo a livello molecolare sia l’espressione di proteine strettamente legate allo OxSt e al suo signaling che l’effetto di tolvaptan sulla loro espressione.

A tal fine, utilizzando un approccio biologico molecolare, abbiamo valutato in questo studio, ex vivo in pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan, lo stato dello OxSt in termini di: espressione proteica nelle cellule mononucleate di p22phox, subunità della NADPH ossidasi, chiave nel trasferimento dell’elettrone per generare anione superossido [16]; stato di fosforilazione di MYPT-1, marker dell’attività della pathway RhoA/ROCK [1315]; livelli di HO-1, proteina indotta e protettiva verso lo OxSt [17]. Questo gruppo di pazienti è stato confrontato con un gruppo ADPKD con funzionalità renale normale non trattati e con un gruppo di soggetti sani.

 

Pazienti e Metodi

Pazienti

Sono stati arruolati in questo studio nove pazienti ADPKD della nostra coorte, 5 femmine e 4 maschi, età media 46 ±5 anni, in trattamento con tolvaptan, seguiti presso il nostro ambulatorio dedicato. Nove pazienti ADPKD non trattati, 7 femmine e 2 maschi, età media 34 ±11 anni, con funzione renale normale (eGFR >80 mL/min/1,73m2), e nove soggetti sani, 5 maschi e 4 femmine, età media 31 ±5 anni, sono stati utilizzati come gruppi di controllo.

Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato allo studio che ha richiesto solo un campione di sangue ottenuto al momento dell’esecuzione dei loro test di controllo biochimici normalmente programmati.

Valutazioni biologico-molecolari

Sono state isolate le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da 20 mL di sangue anticoagulato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) usando Lympholyte-H (Cedarlane, Burlington, Canada). L’espressione proteica di p22phox e lo stato di fosforilazione di MYPT-1 sono stati valutati mediante l’analisi Western blot, come precedentemente riportato [8,9].

Espressione proteica di p22phox e lo stato di fosforilazione di MYPT-1

In breve, l’estratto proteico totale è stato ottenuto per lisi delle cellule mononucleate usando il tampone buffer Tris HCl 20 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, EDTA 5.0 mmol/L, Niaproof 1.5%, Na3VO4 1.0 mmol/L, SDS 0.1%, PMSF 0.5 mmol/L con l’aggiunta di un cocktail di inibitori delle Proteasi (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) e di un cocktail Phosphatase Inhibitor (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA). La concentrazione proteica è stata misurata con bicinchoninic acid assay (BCA ProteinAssay; Pierce). Le proteine sono state separate usando SDS-PAGE in Tris pH 8.3. Il trasferimento delle proteine sulle membrane di nitrocellulosa è stato effettuato con Hoefer TE 22 Mini Tank Transfer Unit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) con l’uso del seguente tampone di trasferimento: 39 mmol/L glycine, 48 mmol/L Tris base, 0.037% SDS (electrophoresis grade), e 20% metanolo. Le membrane sono state incubate per tutta la notte con un anticorpo policlonale primario per l’individuazione di una specifica proteina: anti-p22phox (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA), antiphospho-MYPT (Cell Signaling technology, Danvers, Massachusetts, USA), and anti-MYPT (Cell Signaling technology, Danvers, Massachusetts, USA). Sono stati poi utilizzati anticorpi secondari HRP-conjugated (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden) e le proteine immunoreattive sono state visualizzate con metodo chemiluminescente usando SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate (Pierce). La fosforilazione di MYPT-1 è stata valutata attraverso un’analisi densitometrica semiquantitativa usando il software NIH image. Il rapporto tra phospho-MYPT-1 and MYPT-1 è stato usato come indice della fosforilazione di MYPT-1.

Livello della proteina HO-1

Il livello della proteina HO-1 è stato misurato utilizzando un kit Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) disponibile in commercio (IMMUNOSET® HO-1 human, ELISA development set, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA). In breve, seguendo le istruzioni del produttore, 100 mg del campione sono stati messi in piastre ed incubati con l’anticorpo HO-1 di cattura. Dopo opportuni lavaggi, un anticorpo rilevatore per HO-1 è stato aggiunto e quindi incubato con streptavidina coniugata alla horseradish peroxidase. Infine, dopo un ulteriore lavaggio la piastra è stata incubata con substrato TMB substrate e bloccata con HCl 1N e letta a 450 nm su un Ensight™ Multimode Plate Reader (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). I valori sono stati espressi in ng/mL.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, California, USA). I dati sono stati espressi come media ±deviazione standard. L’ANOVA è stata utilizzata per confrontare le variabili quantitative tra gruppi ed il test t di Student per dati appaiati. Valori del 5% o meno (p <0,05) sono stati considerati significativi.

 

Risultati

La funzione renale come creatininemia ed eGFR dei pazienti ADPKD trattati con tolvaptan era: 126,3 ±13,3 µmol/L e 53,8 ±4,6 ml/min/1,73 m2 rispettivamente. La creatininemia e l’eGFR dei pazienti con ADPKD non trattati erano rispettivamente 78,67 ±11,98 µmol/L e 91,44 ±14,07 ml/min/1,73 m2.

Espressione proteica di p22phox

Come mostrato in Figura 1 A l’espressione proteica di p22phox era significativamente più elevata nei pazienti con ADPKD non trattati rispetto ai pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan e ai soggetti sani: 1,42 ±0,11 d.u. vs 0,86 ±0,15, p=0,015, vs 0,53 ±0,11, p<0,001, rispettivamente.

Stato di fosforilazione MYPT-1

Lo stato di fosforilazione di MYPT-1 era significativamente più elevata nei pazienti con ADPKD non trattati rispetto sia ai pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan che ai soggetti sani: 0,96 ±0,28 d.u. vs 0,68 ±0,09, p=0,013 e vs 0,47 ±0,13, p<0,001, rispettivamente (Figura 1 B).

Livello della proteina HO-1

La Figura 2 mostra che HO-1 era significativamente ridotto nei pazienti con ADPKD non trattati rispetto ai soggetti sani ed ai pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan: 1,97 ±1,22; 2,08 ±0,79, p=0,012, 5,33 ±3,4 ng/ml, p=0,012.

Figura 1: A) L’espressione proteica di p22 phox è significativamente aumentata nei pazienti ADPKD
Figura 1: A) L’espressione proteica di p22 phox è significativamente aumentata nei pazienti ADPKD non trattati in confronto ai pazienti ADPKD trattati (#: p=0.015) ed ai oggetti di controllo(*: p<0.001). La parte alta della figura mostra i prodotti di un Western Blot rappresentativo di un soggetto di controllo, di un paziente ADPKD trattato e di un paziente non trattato. B) Lo stato di fosforilazione di MYPT-1 è significativamente aumentato nei pazienti ADPKD non trattati in confronto ai pazienti ADPKD trattati (#:p=0.013) ed ai soggetti di controllo (*: p<0.001). La parte alta della figura mostra i prodotti di un Western Blot rappresentativo di un soggetto di controllo, di un paziente ADPKD trattato e di un paziente non trattato.
Figura 2: La concentrazione proteica di HO-1 è significativamente ridotta nei pazienti ADPKD non trattati in confronto sia ai controlli che ai pazienti ADPKD trattati con tolvaptan (*: p=0.012)
Figura 2: La concentrazione proteica di HO-1 è significativamente ridotta nei pazienti ADPKD non trattati in confronto sia ai controlli che ai pazienti ADPKD trattati con tolvaptan (*: p=0.012)

Discussione

Il nostro studio mostra, a livello biologico-molecolare, che nei pazienti con ADPKD vi è un’attivazione dello OxSt e che il trattamento con tolvaptan si associa non solo alla riduzione di proteine strettamente coinvolte nel signaling dello OxSt, nell’infiammazione e nel rimodellamento cardiovascolare-renale ma anche all’induzione di meccanismi di difesa/protezione verso lo OxSt. Infatti, lo OxSt come espressione proteica di p22phox e stato della fosforilazione di MYPT-1 è significativamente più elevato nei pazienti con ADPKD non trattati, mentre è significativamente ridotto nei pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan. Inoltre, il livello di HO-1 dei pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan è significativamente più elevato rispetto ai pazienti con ADPKD non trattati.

La p22phox è una subunità della NADPH ossidasi presente sia nei leucociti che nella parete vascolare e funge da subunità essenziale del trasporto finale degli elettroni da NADPH all’eme e all’ossigeno molecolare per generare O2 [17]. Nei pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan, la riduzione del livello della proteina p22phox suggerisce non solo una riduzione dello OxSt, ma anche un’inibizione dell’attivazione leucocitaria, causa nota di OxSt nella CKD. Di conseguenza, questa riduzione dell’espressione proteica di p22phox suggerisce un’inibizione dei meccanismi indotti dal signaling dello OxSt noti come responsabili del rimodellamento vascolare e dell’aterogenesi [5,6].

La pathway RhoA/ROCK è un’altra signaling pathway fondamentale nei processi coinvolti nello OxSt [1315]. La sua attivazione induce OxSt attraverso l’attivazione della NADPH ossidasi e l’attivazione di RhoA/ROCK è coinvolta nell’effetto vascolare dello OxSt [1315]. È stato inoltre recentemente dimostrato che l’attivazione di RhoA/ROCK è indotta a seguito dell’inattivazione di PKD-1 tramite l’attivazione di proteine coinvolte nella cistogenesi [1819], mentre l’inibizione di ROCK riduce l’attività di proteine coinvolte nella cistogenesi, che sono invece stimolate sia in cellule cistiche con PKD1 mutato che in campioni di tessuto renale cistico di pazienti con ADPKD [1819].

L’eme ossigenasi-1 (HO-1) valutata in questo studio è l’isoforma inducibile di HO che è protettiva nei riguardi di processi ossidativi. HO-1 agisce sull’eme, producendo CO e biliverdina, che viene ulteriormente metabolizzata a bilirubina, un potente antiossidante essa stessa. Esistono tre diverse isoforme di HO: HO-1, HO-2 e HO-3. HO-1 ha un’espressione basale molto bassa ma aumenta rapidamente in presenza di stress ossidativo, mentre HO-2 e HO-3 sono costitutivamente espresse [20]. L’HO-1 media la produzione del vasodilatatore CO e contribuisce alla regolazione del tono vascolare e quindi della pressione arteriosa e della funzione endoteliale. Infine, HO-1 ha dimostrato a lungo termine di avere un effetto antinfiammatorio e antiproliferativo [17,21,22].

Tolvaptan è un antagonista del recettore V2 dell’arginina-vasopressina ed il suo uso terapeutico è attualmente indicato per rallentare la progressione dello sviluppo di cisti e dell’insufficienza renale associata all’ADPKD [4]. È stato evidenziato in un modello animale che il trattamento cronico con tolvaptan riduceva significativamente la stimolazione delle subunità di NADPH ossidasi compresa la p22phox, inibiva l’espressione e la fosforilazione di RhoA e la fosforilazione di MYPT-1 [23]. È stato anche dimostrato [24] che l’espressione proteica di NFkB delle cellule endoteliali vascolari era aumentata nell’ADPKD, indicando la presenza di uno stato infiammatorio. Inoltre, l’aumento di OxSt e dell’infiammazione probabilmente contribuisce alla diminuzione della biodisponibilità di NO, come mostrato dalla compromissione della dilatazione endotelio NO-dipendente nei pazienti ADPKD [11]. Infine, è stato anche dimostrato che nelle cellule mpkCCD e nella midollare esterna di reni di topo, il tolvaptan aumentava l’espressione genica e proteica di HO-1 [25].

 

Conclusioni

I risultati del nostro studio mostrano per la prima volta ex vivo nell’uomo che il trattamento con tolvaptan nei pazienti con ADPKD si associa ad una riduzione dello OxSt e ad un aumento di HO-1, protettivo verso OxSt. Sebbene ottenuti da una piccola coorte di pazienti, tuttavia in linea con la natura dell’approccio biologico molecolare dello studio, i nostri risultati supportano quelli ottenuti da studi in vitro o su modelli animali, e forniscono nei pazienti con ADPKD trattati con tolvaptan, un razionale meccanicistico per la protezione verso il peggioramento della funzione renale, il danno endoteliale e l’ipertensione arteriosa attraverso la riduzione di OxSt.

 

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